【摘 要】
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目的研究胆管阻塞性肝纤维化组织中micro RNA的差异性表达及目标靶基因的GO功能富集分析、KEGG信号通路分析,为后期胆管阻塞性肝纤维化的研究提供新的方向与靶点。方法1、研究对象:严格遵循入组标准选取2018年1月至2020年6月于青岛大学附属青岛市市立医院住院治疗的肝组织正常的患者和患有胆管阻塞性疾病的患者纳入研究。2、标本处理:将3例正常肝组织及3例胆管阻塞性肝纤维化组织标本分为两份,一份
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目的研究胆管阻塞性肝纤维化组织中micro RNA的差异性表达及目标靶基因的GO功能富集分析、KEGG信号通路分析,为后期胆管阻塞性肝纤维化的研究提供新的方向与靶点。方法1、研究对象:严格遵循入组标准选取2018年1月至2020年6月于青岛大学附属青岛市市立医院住院治疗的肝组织正常的患者和患有胆管阻塞性疾病的患者纳入研究。2、标本处理:将3例正常肝组织及3例胆管阻塞性肝纤维化组织标本分为两份,一份通过HE及Masson染色明确有无肝纤维化,另外一份冻存用于基因测序。3、基因测序及差异性micro RNA筛选:经过质量检测、文库构建、文库质检、上机测序、micro RNA检测获取已知及未知micro RNA,进一步采用edge R软件筛选出差异性micro RNA。4、靶基因预测及相关性分析:使用miRanda和RNAhybrid两款软件预测靶基因,然后用top GO软件及KOBAS分析分别进行GO功能富集分析及KEGG信号通路分析。5、动物模型的建立:选取雄性Wistar大鼠,将其胆总管结扎2周进行造模,获取肝纤维组织后进行Masson染色验证。6、实时荧光定量PCR:验证Wistar大鼠胆管阻塞性肝纤维化中miR-483-3p的表达,为后期实验的进行初步筛选。结果1、HE及Masson染色:经病理学验证选取的肝组织符合正常肝组织及胆管阻塞性肝纤维化的标准,并对两组Masson染色中胶原纤维的面积进行统计分析存在显著性差异（P<0.05）。2、基因测序及差异性micro RNA筛选:实验中共筛选出micro RNA共1575例,其中已知的micro RNA共1550例,新发现的micro RNA共25例,筛选出已知的差异性micro RNA共44例,其中在纤维化中下调的micro RNA共26例,上调的micro RNA共18例,其中显著差异性表达的micro RNA共5例,在纤维化组织中均表现为下调,分别为miR-483-3p、miR-1271-5p、miR-5589-3p、miR-1295b-3p、miR-7977。3、靶基因预测及相关性分析:预测出差异性表达的micro RNA的潜在目标靶基因,通过GO功能富集分析进一步验证了相关基因的分子功能、所处的细胞位置、参与的生物过程,KEGG信号通路分析靶基因主要作用于Metabolic通路。4、动物模型的建立:雄性Wistar大鼠经过2周时间的胆管结扎,经Masson染色验证后发现肝小叶正常结构紊乱,胶原纤维增多,肝纤维化明显。5、miR-483-3p的低表达:本研究中评估了miR-483-3p在Wistar大鼠胆管阻塞性肝纤维化中下调,可用于后期实验研究。结论1、经过两组肝脏组织对比共筛查出显著差异性表达的micro RNA共5个:miR-483-3p、miR-5589-3p、miR-1271-5p、miR-1295b-3p、miR-7977,提示这些基因可能参与肝纤维化的进程。2、研究已明确靶基因相关的分子功能、细胞成分及参与的生物过程,并通过以下信号转导通路可能对胆管阻塞性肝纤维化产生影响,如代谢通路、肿瘤通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、Ras信号通路及Rap1信号通路等。3、miR-483-3p经过PCR进一步验证在胆管阻塞性肝纤维化模型组织中下调,具体机制还需后期实验进一步验证。
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