背景肠道菌群是人体最复杂也最重要的微生态系统,具有为人体提供营养、调控肠道上皮的发育以及促进免疫系统的发育与成熟、保护宿主免受外来病原体的攻击等功能。肠道菌群能够诱发先天及后天免疫反应,例如肠道淋巴组织的成熟必须通过菌群和肠道上皮细胞及树突状细胞,进而调控T细胞和B细胞。系统性红斑狼疮(systemiclupus erythematosus,SLE)是一种累及多系统多器官的自身免疫性结缔组织病。目前临床上常用的药物(激素、免疫抑制剂等)长期使用副作用很大,且只能控制病情。肠道微生态与自身免疫性疾病相关,SLE患者免疫力紊乱,机体内环境及肠道屏障功能改变导致肠道微生态紊乱。以往研究主要采用反转录 PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)等分子生物学方法及生物芯片对肠道菌群进行研究,这些方法存在包括检测通量低,无法准确反应微生物的丰度,无法检测痕迹量微生物,无法探索未知微生物等缺点。本研究采用荧光定量PCR对肠道优势菌群进行定量分析,分析SLE患者的肠道优势菌群及肠道定植抗力的变化情况,揭示SLE患者的肠道优势菌群的变化情况;在此基础上,采用新一代测序技术IlluminaPE250/PE300测序对粪便样本中的细菌16SrRNAV3区进行定型分析,识别与SLE病情相关的标志性菌属,揭示SLE与肠道微生态的相互关系,为SLE的诊断治疗提供新的依据。方法本研究第一部分通过对2015年1月至2016年10月在浙江大学医学院附属第一医院门诊或病房就诊的32例SLE患者,其中16例为初诊的SLE患者(首次确诊且未经激素或免疫抑剂治疗的SLE患者),16例为复诊SLE患者(已经确诊并经过激素或免疫抑剂治疗SLE患者)进行研究,同时纳入26例浙江大学医学院附属第医院健康体检者作为健康对照组,收集各研究对象的临床资料、血浆标本、粪便标本,用玻璃珠击打法来提取粪便DNA,利用荧光定量PCR检测肠道优势菌群。通过细胞因子液相基因芯片技术检测SLE患者的血浆细胞因子,从临床医生角度直观揭示SLE患者的肠道优势菌群的变化情况,进一步探究与SLE疾病发生相关的炎症细胞因子间的关系。本研究第二部分通过在前期粪便DNA抽提的基础上进行16SrRNAV3区PCR扩增,以及IlluminaPE250/PE300测序,最后进行基因序列的生物信息学分析,寻找系统性红斑狼疮患者肠道菌群的生物标记物。结果1、本实验入组的SLE患者,男女比例为1:9.6,年龄在16-68岁,初诊(新发)与复诊患者各16人,其中初诊患者中男女比例为1:15,平均发病年龄为33.82±14.15岁;复诊患者中男女比例为1:7,平均年龄38.56±15.54岁,都是处于疾病活动期的患者。SLE初诊患者与复诊患者的肠道优势菌群未见明显统计学差异,而总体上与健康对照组相比,SLE患者的肠道有益细菌双歧杆菌及B/E值显著降低(P<0.001),而直肠真杆菌以及有害细菌肠杆菌均显著增多(P<0.001)。2、SLE患者肠道中的肠球菌与SLE疾病活动度评分(SLEDAI)呈正相关(R=0.41,P=0.0197)。3、SLE血浆中的促炎细胞因子IL-1β(白细胞介素-1β)和IL-1ra(白细胞介素1受体拮抗剂)较健康对照组均显著增加(P<0.001);免疫调节因子IL-10(白细胞介素-10)(P<0.05)、IL-12(白细胞介素-12)(P<0.01)水平明显高于健康对照组;具有多功能和多效性的细胞因子TNF-α(肿瘤坏死因子α)在SLE患者中明显高于健康对照组(P<0.05);然而,在SLE具有重要作用的IL-17(白细胞介素-17)在SLE患者与健康对照组相比并无明显统计学差异(P>0.05)。4、58个样本中一共获得2,843,401条有效序列(健康对照样本获得1,269,735条有效序列,平均每个样本为48,836条序列;SLE患者样本共获得1,573,666条有效序列,平均每个样本49,177条序列)。反映群落丰富度的sobs、chao、ace指数在SLE患者略高于健康对照组,但两组之间无统计学意义(P>0.05);而反映群落多样性的shannon及coverage指数在SLE组显著下降(P<0.05),simpson指数在SLE组显著高于健康对照组(P<0.05),SLE患者肠道菌群多样性发生了一定的变化。5、在OTU(可操作分类单元)分类水平,SLE组及健康对照组组间差异性显著大于具内差异,具有统计学意义(P=0.001)。在属的分类水平上,SLE组患者个体间的离散程度较健康对照组明显,肠道菌结构个体间差异较大。肠道菌群序列分类显示,拟杆菌门及厚壁菌门约占总序列数的85%以上,是肠道菌群中的绝对优势菌群,相比于健康对照组,在门的水平,SLE患者肠道菌群中的拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门以及梭杆菌门所占比例无明显差异,放线菌门比例显著增加(1.14%vs 0.15%,P>0.0497);在科的水平,SLE组肠道菌群中的瘤胃球菌科、脱硫弧菌科显著减少,而肠球菌科比例显著增加(4.88%vs 0.0004%,P<0.01);在属的水平上,SLE组肠道菌群萨特氏菌属、普拉梭菌显著减少,而韦荣氏球菌属(2.15%vs 0.16%,P<0.01)、肠球菌(4.88%vs 0.0004%,P<0.01)属却显著增加。6、基于多级物种判别分析发现,从科到属的水平分析发现,SLE组中共有41个丰度有显著差异的物种,肠球菌属与韦荣球菌属在SLE组中差异极显著(P<0.01),且对丰度差异的影响力占主导地位,在本实验中可被认为是区分SLE患者的主要差异菌群。结论SLE患者肠道的条件致病菌肠杆菌比例明显增加,而有益菌双歧杆菌比例显著减少,故肠道定植抗力B/E值明显降低,这些肠道优势菌群结构的改变导致了肠道微生态失衡,主要通过影响肠道黏膜的免疫功能,从而使机体免疫系统功能紊乱,可能与SLE疾病的发生发展相关。SLE患者肠道菌群群落的多样性发生了一定变化;且与健康对照组组间差异明显大于组内差异,实验可信度较高。SLE组患者肠道菌结构个体间差异较大。SLE患者肠道潜在的致病菌如韦荣球菌、肠球菌细菌比例明显增加,而肠道常驻菌毛螺菌比例显著减少,这些菌群结构的改变可能与SLE患者有无并发症、所并发的胃肠道损害程度以及肾脏累及情况的不同有关。肠球菌及韦荣氏球菌对差异物种丰度的影响力较大,可认为是SLE患者的主要差异菌群。同时血浆中的促炎及具有免疫调节作用的细胞因子在SLE患者中显著增加,进一步证明了 SLE患者免疫功能紊乱。以上结果对今后SLE在疾病诊断方面以及可能涉及到的发病机制、肠道微生态治疗以及细胞因子疗法等方面提供了一定的证据支持。