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第一部分利用昆虫细胞杆状病毒表达系统制备人乳头瘤病毒18型L1蛋白并在体外研究其相关免疫效应目的:制备和纯化人乳头状瘤病毒(Human papilloma virus, HPV)18型L1蛋白并观察其体外活性。方法:利用Bac to Bac昆虫细胞杆状病毒表达系统,用PCR方法克隆HPV18 L1基因,测序鉴定后与线性化的pFastHTb进行连接为pFastHTb-HPV18Ll,使pFastHTb-HPV18Ll与DH10BAC感受菌进行转座重组,利用抗性及蓝白斑筛选重组Bacmid-HPV18LI克隆,提取Bacmid-HPV18L1转染昆虫细胞Sf-9获得有感染力的病毒,利用病毒感染Sf-9细胞进行蛋白表达扩增,用RT-PCR和Western blot进行鉴定;透射电镜观察纯化前后的病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)的形态及表达情况;用Ni-NTA His?Bind? Resins系统纯化融合有组氨酸标签的目的蛋白;以小鼠红细胞凝集试验鉴定蛋白生物活性;通过ELISPOT检测纯化后的L1蛋白与病人外周淋巴细胞共培养后IFN-γ的表达情况,以此检测HPV18 L1-VLP的免疫源性。结果:收集被转染的Sf-9细胞,提取细胞蛋白,SDS-PAGE检测可见在大约63KDa处出现一新生蛋白条带,Western blot证实为HPV18L1蛋白;透射电镜观察证实L1蛋白可自我组装成VLP且主要定位于细胞核;小鼠红细胞凝集试验证实纯化的蛋白在50～400ng/100μl可介导小鼠红细胞凝集;在HPV18阳性组病人的IFN-γ表达水平明显高于(P<0.05)混合高危型HPV感染组病人和无HPV感染组。结论:Bac to Bac昆虫细胞杆状病毒表达系统可高效地制备HPV VLP,并具有良好的分子生物学活性、抗原性和免疫源性,为其作为预防HPV18感染的疫苗奠定了基础;Ni-NTA系统能高效简便的纯化带有6×His短肽的HPV18L1蛋白;ELISPOT的结果提示由HPV18L1-VLP引发的细胞免疫反应可能在高危型HPV中存在交叉反应。第二部分人乳头瘤病毒16/18型E5致病机制探讨目的:人乳头瘤病毒16/18型( human papillomavirus 16/18, HPV16/18)的早期基因E5可通过多种途径刺激细胞转化和恶性增殖,并可辅助和加强E6,E7的致病作用,与宫颈癌的发生密切相关。本研究通过构建和筛选持续表达HPV16/18E5的细胞SiHa/16E5,HeLa/18E5,C33A/16E5,293/16E5探讨HPV16/18E5对HPV阳性/阴性细胞及宫颈癌细胞/正常细胞的作用及其机制;通过同时构建pEGFP-N1/C1两种载体质粒,探讨E5蛋白的穿膜方向(N端或C端)。方法:利用pEGFP-N1/C1构建HPV16/18型E5的正义全长真核表达载体并稳定转染SiHa,HeLa,C33A,293细胞;利用RT-PCR和Western blot技术检测转染前后E5及相关基因的mRNA和蛋白表达情况;用荧光显微镜和共聚焦显微镜观察E5蛋白的定位;利用MTT法检测稳定转染前后细胞的增殖活性;利用软琼脂克隆形成实验在体外验证稳定转染前后细胞的致瘤情况;用流式细胞仪(Fluorescence activated cell sorter,FACS)检测稳定转染前后细胞周期及KI67表达的变化;用Transwell实验探讨稳定转染前后细胞的侵袭转移能力的变化;用免疫沉淀(Immunoprecipitation ,IP)实验探讨HPV16 E5可能的作用机制;用免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)方法在组织水平检测与HPV16/18 E5致病可能相关的因子在宫颈病变不同阶段的表达情况。结果:稳定转染携带HPV16/18全长E5基因的质粒后, pEGFP /C1载体的各质粒有很强的膜定位信号;各细胞中E5基因的mRNA和相应蛋白表达明显升高,而P21,BUB1,MAD2的表达则明显下调; MTT结果显示稳定转染后细胞的增殖活性与转染空载体细胞和未转染细胞比较明显增高(P<0.05) ;软琼脂克隆形成结果示:SiHa/16E5细胞组的可隆形成数为33.4±1.6 ,与空质粒对照组细胞(15.1±3.1)及未转染组细胞(16.3±2. 5)比较有显著性差异( P<0.05);流式细胞仪结果示稳定转染后S期细胞明显增多(P<0.05),KI67的表达也显著上升(P<0.05); Transwell提示稳定转染后细胞侵袭能力有明显增强(P<0.05); IP实验结果证实HPV16 E5与BUB1有相互作用;在组织水平BUB1和MAD2的表达随宫颈病变的进展而逐渐减少。结论:同时构建pEGFP-N1/C1两种载体质粒可以有效判断膜蛋白的N端或C端穿膜的情况; HPV16/18 E5可能通过影响纺锤体检测点蛋白的表达或组装,影响细胞周期,同时还可降低细胞中P21的表达,进一步促使细胞的加速增殖甚至恶性转化,从而增强了细胞的致癌能力;HPV16/18 E5可能通过PI3K/AKT通路加剧了细胞侵袭转移的潜能,在宫颈癌早期对疾病的发生发展有重要作用。第三部分HPV16阳性的宫颈癌多肽疫苗的相关研究目的:用AAV-TC-1(E5)构建肿瘤动物模型;以HPV16E5,E6,E7为基础,研制HPV16阳性的宫颈癌三肽疫苗。方法:用腺相关病毒表达系统构建AAV- TC-1(E5),并注入C57BL/6小鼠,使之成瘤(HPV16E5,E6,E7阳性),建立HPV16E5,E6,E7阳性的动物肿瘤模型;依托本实验室的生物信息学平台,以HPV16E5,E6,E7序列为基础,分析针对于人和C57BL/6小鼠的MHC-1分子抗原识别位点,筛选相关肽段进行体外制备和纯化。将三肽结合CpG序列的疫苗,从预防和治疗两个角度对小鼠进行干预,将实验动物分为三肽,二肽,单肽,佐剂组和对照组。观察实验组和对照组的肿瘤生长状况;干预后40-50天,小鼠眼球后取血,结合ELISA观察外周血中各免疫指标的表达差异;分离小鼠脾淋巴细胞与AAV-TC-1(E5)细胞共培养,结合FACS分析小鼠脾淋巴细胞的杀伤效应;剥离小鼠肿瘤组织,提取组织里的RNA和蛋白质,结合Realtime-RT PCR和Western Blot分析肿瘤微环境中各免疫学相关因子的表达情况;将剥离的小鼠肿瘤组织切片,石蜡包埋,用IHC方法检测肿瘤组织中相关指标的表达。结果:成功构建HPV16E5,E6,E7阳性的动物肿瘤模型;三肽联合预防组小鼠完全无瘤生存; ELISA结果示三肽组IFN-γ,IL-2等TH-1类免疫指标表达明显高于对照组,佐剂组,单肽组(P均〈0.01)和二肽组(P<0.05); FACS检测示:干预组小鼠淋巴细胞在体外对AAV-TC-1(E5)细胞也有明显的杀伤效应;肿瘤微环境中的各免疫指标如: IFN-γ,IL-2等表达干预组较对照组有显著升高(P<0.05);IHC示,肿瘤组织中以CD8阳性的细胞为主,且多肽干预组较对照组阳性率明显升高(P〈0.05).结论:以HPV16E5,E6,E7为基础的HPV16阳性的宫颈癌三肽疫苗可以有效的预防和治疗HPV16阳性的肿瘤,有较好的临床应用前景。