大豆基质金属蛋白酶基因Gm1-MMP和Gm2-MMP的分离以及响应高温高湿胁迫的功能分析

来源 :南京农业大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:lanaya0903
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基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)是一类高度保守的锌钙依赖型的内肽酶家族。在植物生长发育以及应答生物和非生物胁迫过程中具有重要的作用。大豆[Glycine max(L.)Merr.]是世界上重要的油料作物,在我国种植业结构调整中发挥重要作用。我国南方春大豆种子生理成熟期往往会遇到高温多雨的夏季,导致种子发生田间劣变,严重影响了春大豆的产量和品质。本课题组前期的差异蛋白质组学研究结果表明高温高湿(40℃/100%RH)胁迫后Gm1-MMP蛋白在抗田间劣变品种中与对照相比显著上调表达,表明Gm1-MMP可能响应高温高湿胁迫从而参与春大豆种子田间劣变抗性。为进一步研究大豆MMPs在响应高温高湿胁迫中的功能,本研究拟选用Gm1-MMP和Gm2-MMP两个基因作为研究对象,以种子田间劣变抗性品种湘豆3号和不抗品种宁镇1号为材料,在此基础上开展以下研究:(1)大豆Gm1-MMP和Gm2-MMP的分离、生物信息学分析及其编码蛋白的亚细胞定位;(2)Gm1-MMP和Gm2-MMP基因在不同组织器官、种子发育过程以及高温高湿(40℃/100%RH)胁迫下的表达特性分析;(3)Gm1-MMP互作蛋白的筛选与鉴定;(4)Gm1-MMP与GmMT-Ⅱ互作的验证、互作位点分析以及GmMT-Ⅱ的表达特性分析;(5)Gm1-MMP和Gm2-MMP参与生长发育及响应高温高湿胁迫的功能验证。主要研究结果如下:1、Gm1-MMP基因cDNA序列包含一个915bp的开放阅读框(ORF),不含内含子。Gm1-MMP具有MMPs家族典型的信号肽、前肽、催化区结构域,编码的蛋白与其他物种的同源性不高。对Gm1-MMP基因启动子序列分析发现,Gm1-MMP启动子中转录起始位点(TSS)在ORF上游78 bp处,含有2个热激响应元件以及其他多种响应逆境胁迫的顺式作用元件。通过对Gm1-MMP基因启动子5’端不同缺失片段驱动的GUS基因在烟草叶片中的瞬时表达分析发现,-399~-299bp对该启动子的高温高湿诱导活性是必须的。Gm2-MMP基因cDNA序列包含一个1071 bp的开放阅读框(ORF),同样不含内含子。生物信息学分析发现,Gm2-MMP除具有MMPs家族典型结构域,还包含跨膜结构域。基因枪介导的洋葱表皮细胞和烟草叶肉细胞GFP瞬时表达实验表明,Gm1-MM和Gm2-MMP基因编码的蛋白都定位在细胞膜上。2、qRT-PCR结果表明,Gm1-MMP和Gm2-MMP基因在田间劣变抗性品种湘豆3号和不抗品种宁镇1号中均表现为在成熟叶片、老叶及成熟种子中表达量较高,其他组织中表达量较低。并在大豆种子发育过程中持续表达,且在种子发育的中后期有较高的表达。生理成熟期高温高湿胁迫后,在湘豆3号的叶片中,与对照组相比,Gm1-MMP基因在胁迫处理48 h以后表达量显著上调,而宁镇1号的叶片中,在相同的时间点表达量显著下调,但在处理12 h时,该基因的表达量显著高于对照。在湘豆3号的种子中,与对照组相比,Gm1-MP基因在胁迫处理12、48、96和168 h时表达量显著上调,而宁镇1号的种子中,仅在处理12h时,该基因的表达量显著高于对照。在湘豆3号的叶片中,与对照组相比,Gm2-MMP基因在胁迫处理24 h以后表达量显著上调,而宁镇1号的叶片中,在处理12 h和24h时表达量显著上调。在湘豆3号的种子中,与对照组相比,Gm2-MMP基因在胁迫处理96 h和168 h时表达量显著上调,而在宁镇1号的种子中,仅在处理168 h时,表达量显著高于对照。3、以Gm1-MMP为诱饵去筛选实验室前期构建的高温高湿胁迫下春大豆种子田间劣变抗性品种的种子膜蛋白酵母双杂交文库,通过营养缺陷型培养基和X-α-Gal染色共筛选14个可能与Gm1-MMP互作的蛋白;利用NCBI数据库和UniProt蛋白数据库检索这14个互作蛋白的功能,共可以分为7类,分别为种子贮藏蛋白(5个)、种子成熟蛋白(2个)、金属离子结合蛋白(2个)、GTP酶活化蛋白(1个)、泛素化途径蛋白(1个)、蛋白酶抑制剂(1个)和功能未知蛋白(2个)。4、从大豆cDNA中分离到了 GmM1-Ⅱ基因,该基因的ORF全长为255 bp,编码85个氨基酸,保守结构域包含3个Cys富集区域,属于Type4MTs,并与AhMT4以及AtMT4A的亲缘关系较近。基因枪介导的洋葱表皮细胞和烟草叶肉细胞GFP瞬时表达实验表明,GmMT-Ⅱ基因编码的蛋白均匀分布在整个细胞中。利用酵母双杂交技术和双分子荧光互补实验(BiFC)验证了 Gm1-MMP和GmMT-Ⅱ蛋白在体内存在互作关系。对它们的互作位点分析表明,Gm1-MMP保守结构域的前肽区能够结合GmMT-Ⅱ蛋白,GmMT-Ⅱ蛋白中只要存在一个Cys富集区就可结合Gm1-MMP蛋白。qRT-PCR结果表明,GmMT-Ⅱ基因在湘豆3号和宁镇1号的种子中表达量最高,在其他组织中表达量很低甚至不表达,在种子发育过程中GmMT-Ⅱ呈现先升后降的趋势,并在花后45天的种子中表达量达到最大。生理成熟期高温高湿胁迫后,在抗性品种湘豆3号的种子中,与对照组相比,处理48、96和168 h时表达量显著上调(P<0.01),而不抗品种宁镇1号的种子中,仅在处理12h时,GmMT-Ⅱ基因的表达量显著高于对照。5、异源表达结果表明,过表达Gm1-MMP和Gm2-MMP均能导致拟南芥的叶片更加茂盛,并且部分茎生叶莲座化。石蜡切片结果显示Gm1-MMP和Gm2-MMP转基因拟南芥植株叶脉的海绵细胞变大,栅栏细胞排列松散,节点细胞向四周发生极性扭曲。另外,过表达Gm1-MMP和Gm2-MMP均导致拟南芥气孔长度变小,气孔密度以及气孔开度增加。对生长4周的拟南芥植株进行高温高湿处理发现:Gm1-MMP和Gm2-MMP过表达拟南芥植株受损伤程度远低于野生型(WT)植株,气孔仍保留一定开度,叶绿体结构完整,未遭到严重破坏。对拟南芥植株荚黄熟期进行高温高湿处理后,Gm1-MMP和Gm2-MMP过表达植株的发芽率、成苗率和种子生活力显著高于WT。另外,Gm1-MMP过表达植株种子中积累的H202和ROS含量远低于WT。以上结果表明,Gm1-MMP和Gm2-MMP在生长发育及响应高温高湿胁迫过程中发挥了重要的作用。通过以上研究,为进一步深入研究大豆MMPs基因在参与大豆生长发育和响应逆境胁迫等方面的生物学功能奠定分子基础。
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