【摘 要】
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橡胶草(Taraxacum kok-saghyz Rodin)是一种菊科蒲公英属多年生草本植物,橡胶草与银胶菊、巴西橡胶树并称世界三大产胶植物。与巴西橡胶树相比,橡胶草具有生命周期短、种子数量多、种子体积小以及遗传转化相对容易等诸多优点,成为研究产排胶机理的理想的模式植物。在前期研究中,我们发现冷胁迫应答基因的表观遗传学修饰是巴西橡胶树适应冷害的重要机制。本文为了解析产胶植物的冷胁迫应答分子机制,
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橡胶草(Taraxacum kok-saghyz Rodin)是一种菊科蒲公英属多年生草本植物,橡胶草与银胶菊、巴西橡胶树并称世界三大产胶植物。与巴西橡胶树相比,橡胶草具有生命周期短、种子数量多、种子体积小以及遗传转化相对容易等诸多优点,成为研究产排胶机理的理想的模式植物。在前期研究中,我们发现冷胁迫应答基因的表观遗传学修饰是巴西橡胶树适应冷害的重要机制。本文为了解析产胶植物的冷胁迫应答分子机制,以橡胶草为实验材料,研究其冷胁迫应答及相关基因的组蛋白修饰,摸索橡胶草遗传转化体系并转化冷胁迫相关基因,得到以下研究结果:1.橡胶草冷胁迫下的生理生化变化:4℃冷处理诱导叶片花青素大量积累,导致叶片颜色变紫;冷胁迫处理3天后,叶片电导率快速增加;冷胁迫诱导脯氨酸(proline,Pro)和丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)的含量增加非常明显,达到为处理前的2.5倍,随后大幅降低;冷胁迫还提高超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)的水平。2.橡胶草冷胁迫应答基因的差异表达:冷处理的过程中我们发现5d作为一个关键时间节点,冷处理5d后,多个冷胁迫应答基因的表达量达到了最高值,随后有所下降;其中Tks CBF1的表达量升高最明显,但在随后其表达量恢复到了未经过冷处理的水平;与蔗糖合成相关的基因Tks COR15a的表达量在经过最高峰后,依旧保持一个较高的转录水平。3.橡胶草冷胁迫应答基因的组蛋白修饰:橡胶草冷胁迫应答基因的H3K4me3和H3K27me3这两个组蛋白修饰在冷胁迫处理后明显增加,主要变化发生在冷胁迫3d和5d后;除了Tks ICE1的H3K36me3在5d后依旧有所保持,其他冷胁迫应答基因在不同程度上的逐渐恢复正常。4.橡胶草转录组测序(RNA-seq)和染色质免疫共沉淀测序(CHIP-seq)关联分析:本文研究采用10℃冷处理后第10天的橡胶草叶片进行RNA-seq和H3K27me3富集的Ch IP-seq测序分析,发现RNA-seq有8802个冷诱导差异表达基因,其中上调表达4075个,下调表达4727个。通过与Ch IP-seq的差异表达基因关联分析发现,共有44个基因在Ch IP-seq和RNAseq中都是下调表达,有19个基因在Ch IP-seq和RNA-seq中都是上调表达。有32个基因在Ch IP-seq中上调而在RNA-seq中下调,有21个基因在Ch IP-seq中上调而在RNA-seq中下调,这些结果表明冷诱导染色质组蛋白H3K27me3修饰改变与基因表达调控存在一定的关联性。5.橡胶草遗传转化:首先进行了橡胶草遗传转化体系的建立,筛选最佳的橡胶草不定芽诱导分化条件:NAA浓度为0.1 mg/L,6-BA浓度为0.5 mg/L时,利于叶、叶柄、根三种外植体诱导分化再生苗。最佳的橡胶草诱导生根的条件:当NAA的浓度为0.3 mg/L时,利于橡胶草分化苗生根。利用该转化体系,本文成功转化Hb ICE1基因到橡胶草,得到转基因植株。综上所述,橡胶草的遗传转化的条件通过实验后得到优化条件,并且在此基础上通过转化Hb ICE1的基因得到了验证。并且对冷敏感的橡胶草冷处理发现橡胶草对冷信号的响应时间节点为5d,5d后橡胶的各项生理生化指标、冷胁迫相关基因表达量和H3K27me3、H3K27me3的修饰等均显示出没有明显的变化,表明橡胶草对冷信号的响应已得到下降。
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