增塑剂邻苯二甲酸二乙基已酯(di-(2-ethyl hexyl)phthalate, DEHP)是一种具有弱雌激素和抗雄性激素的活性的环境内分泌干扰物,它对野生动物和人类的生殖发育毒性已引起广泛关注,但人们对DEHP的神经发育毒性还缺乏认识。研究发现围生期DEHP暴露性别特异性地改变子代大鼠下丘脑视前区芳香酶活性而影响雌激素合成,生命早期暴露于低剂量的DEHP使得雄性大鼠仔鼠血清睾酮显著下降。体外培养的肝细胞DEHP显示出雌激素的效应。以往体外研究也表明,根据浓度不同,DEHP既可以激活ER而表现出雌激素效应,也可以拮抗17p-雌二醇与ER的结合而表现出抗雌激素效应。从而干扰人和动物的内分泌系统。DEHP及其代谢物具有弱雌激素样活性,可干扰体内雌激素和雄激素的正常活动,且由于DEHP的初级代谢产物MEHP能够穿过胎盘屏障及进入母乳,其毒性作用在妊娠期和哺乳期就可以表现出来,可影响性激素敏感组织的发育和长期功能。然而性激素不仅调节机体的生殖发育,研究表明,妊娠期和新生儿期大脑的发育和完善对雌激素样活性物质特别敏感。特别是海马,研究表明海马既是DEHP敏感的脑区也是与行为密切相关的脑区。雌激素可通过雌激素受体p(ERβ)调节脑发育和再生密切相关的过程(如突触的形成,树突的延伸和分支,神经递质和神经肽的合成)；能够在几分钟内快速诱导多种脑内细胞产生效应,迅速激活多种激酶,如快速激活ERK1/2,进而影响ERK1/2信号转导途径参与的LTP形成及学习、记忆等认知功能。研究表明雌激素的抗焦虑作用是通过ERβ介导的。此外有报道睾酮及5α-二氢睾酮能够减少啮齿类动物的焦虑样行为。刚出生的雄性幼鼠给予雄激素受体(AR)拮抗剂氟他胺结果发现青春前期在强迫游泳和蔗糖偏好测试中抑郁样行为增加,对抑郁行为的影响伴随着海马神经发生和树突棘的下降。NMDA受体为所有兴奋性突触的突触后必需组份,是脑内最重要的兴奋性氨基酸受体,参与调节神经元迁移、树突和轴突发育、突触形成与可塑性、学习记忆等活动。此外鉴于谷氨酸能递质系统与焦虑和抑郁行为密切相关,我们设想DEHP暴露影响学习记忆、焦虑和抑郁样行为可能与海马的谷氨酸递质系统、雌、雄激素及其受体有关,ERK1/2信号通路也可能参与了这一过程的调节。研究内容：围生期(妊娠期及哺乳期)母鼠DEHP暴露对青春期及成年期仔鼠的活动性、探究、焦虑、抑郁、空间记忆行为的影响；围生期DEHP暴露对小鼠血清睾酮和雌二醇含量的变化的影响；DEHP暴露对MDNA受体NR2B亚基及ERK1/2磷酸化水平(P-ERK1/2)和雌激素受体(ERβ)和雄雌激素受体(AR)表达的影响。研究方法：母鼠从妊娠第7天至断乳前(产后21天)进行DEHP(10、50、200mg/kg/day)灌胃染毒,同时设空白对照组及溶媒对照组。仔鼠出生后第6周和第12周时每个剂量组分别采用旷场、高架十字迷宫、强迫游泳和Morris水迷宫等模型检测DEHP对仔鼠的活动性、探究、焦虑、抑郁、空间记忆行为的影响。分别选未进行行为测试的6周及12周小鼠,按要求取海马,Western blot检测NMDA受体NR2B亚基,ERK1/2及ERK1/2磷酸化水平,雌激素受体β(ERβ)、雄激素受体(AR)蛋白的表达。放射免疫法检测雌性小鼠血清中雌二醇的含量以及雄性小鼠血清中睾酮的含量。研究结果：1.围生期10-200mg/kg/day DEHP暴露不影响母鼠的产仔数及各组仔鼠出生第3天的体长。没有明显改变6周雄性仔鼠的体重及6周龄雄性仔鼠的睾丸系数,显著增加10mg/kg/day和200mg/kg/day雌性仔鼠的体重(p<0.001)；12周龄仔鼠中仅50mg/kg/day雄性仔鼠观察到体重显著增加p<0.05)。两个时期所有剂量组动物生殖器系数均没有明显改变。2.血清激素水平检测发现10～200mg/kg/day范围的低水平DEHP暴露使得仔鼠的激素水平在一定程度上下降,但是与对照组相比均没有显著性。3.行为检测结果：1)旷场行为检测发现,围生期DEHP暴露对青春动物的影响表现为200mg/kg/day的DEHP显著增加雄鼠的理毛次数p<0.05),而10、200mg/kg/day的DEHP显著减少了雌性仔鼠的站立次数p<0.01；p<0.05),并因此消除理毛和站立行为的性别差异。围生期DEHP暴露主要影响成年期雌性仔鼠的开场行为,10mg/kg/day的DEHP显著增加雌鼠的理毛次数(p<0.01),10.200mg/kg/day的DEHP减少雌鼠的3min跑格数p<0.05)。结果表明围生期DEHP暴露可抑制成年期雌性动物活动性,对其矛盾冲突心理影响加大,但对雄性的影响较小。以上结果表明,围生期DEHP暴露可抑制青春期和成年后雌性仔鼠的探究意愿和活动性,增加青春期雄性仔鼠和成年后雌性仔鼠的矛盾冲突心理。2)高架十字迷宫行为检测发现,围生期DEHP暴露对仔鼠焦虑样行为仅在青春期影响显著,表现为正常青春期仔鼠在高架十字迷宫中的多种行为均表现出性别差异,显示出雌鼠有较高的活动性p<0.05)、较低的焦虑状态p<0.01)和探究意愿(p<0.05)。而围生期DEHP暴露对仔鼠在开放臂的进入次数和停留时间表现出性别特异性作用,即10.200mg/kg/day DEHP抑制雌鼠在开放臂的进入次数p<0.001)和停留时间(p<0.01,p<0.05),而雄鼠仅200mg/kg/day DEHP暴露组开放臂的进入次数减(p<0.01),而10.50mg/kg/day组停留时间百分比显著减少(p<0.01,p<0.001),同时消除了性别差异,促进雌、雄性仔鼠的焦虑样状态。以上结果表明,围生期DEHP暴露可诱发青春期动物焦虑样行为,然而对成年期动物无显著影响。3)水迷宫行为检测发现围生期DEHP暴露主要影响6周龄雄鼠的水迷宫行为,对成年后(12周)雌雄仔鼠的行为没有显著作用。与溶媒对照组相比,50和200mg/kg/day DEHP显著延长了6周雄鼠在第3天和第4天航行训练中搜索平台的潜伏期(p<0.05和p<0.05),50mg/kg/day DEHP显著减少6周龄雄鼠在目标象限停留时间(p<0.05)。以上结果提示围生期DEHP暴露主要损伤青春期雄鼠仔鼠的空间学习记忆。4)强迫游泳行为检测发现,围生期DEHP暴露对青春期及成年期雌雄性动物均有显著影响,然而青春期雄性两个剂量组观察到抑郁样行为增加,而成年期仅一个剂量组观察到,因而与其他模型结果相似的是成年期影响程度较青春低。4.进一步的Western blot分析显示,围生期DEHP暴露显著下调了青春期雄性仔鼠海马NMDA受体NR2B亚基的表达,而对雌性及成年期雌雄仔鼠的表达没有影响。雌激素受体β(ERP)在青春期和成年期的表达影响不一致,下调了6周雌雄仔鼠和12周仔鼠雌激素p受体(ERβ)的表达；此外抑制6周龄雌雄仔鼠而对12周龄雌雄仔鼠海马脑区AR的表达无显著。抑制6周雌雄仔鼠ERK1/2的磷酸化水平,对12周雌雄仔鼠ERK1/2的磷酸化水平无显著影响。结论：围生期DEHP暴露可影响子代小鼠青春期和成年期的多种行为及行为的性别差异,不同行为对DEHP的敏感程度不同,其中以学习记忆和焦虑抑郁行为最敏感,且相同暴露时间DEHP对青春期的影响较成年期远期的影响大。DEHP对小鼠神经行为发育改变的同时下调了雌、雄激素受体的表达,因此DEHP对行为的影响可能是通过干扰激素及其受体来进行的,与行为密切相关的ERK1/2信号转导通路及兴奋性谷氨酸NMDA受体NR2B亚基也可能参与这一过程的调节。