目的:本研究基于“脑髓”理论,从中风病“髓虚毒损”的病机关键入手,通过行为学、病理学、分子生物学等研究手段,对VD大鼠的认知功能、海马病理及超微结构变化、海马组织PI3K/Akt细胞信号转导通路相关蛋白、基因表达等方面进行检测和分析,探讨益髓解毒法对VD大鼠认知功能及海马神经元损伤和凋亡的作用及机制,为VD的中医病机认识和治疗提供新的作用靶点和实验证据。方法:1.将健康SPF级雄性SD大鼠,行双侧颈总动脉永久性结扎法(2-VO),复制VD动物模型,将造模成功的大鼠随机分为5组,分别是血管性痴呆模型组(模型组)、盐酸多奈哌齐对照组(阳性对照组)、益髓解毒高、中、低剂量组(中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组),每组各15只,另选取15只只分离未结扎颈总动脉的大鼠作为假手术组。造模后第2d开始灌胃治疗,各组每日灌胃药物及剂量分别是,假手术组和模型组:0.9%生理盐水;阳性对照组:盐酸多奈哌齐溶液,0.052mg/kg;中药高、中、低剂量组:益髓解毒中药复方农本方颗粒溶液,22.22g/kg、11.11g/kg、5.56g/kg,等体积(1mL/100g)灌胃,持续30d治疗结束。2.Morris水迷宫对大鼠进行行为学功能监测,灌胃治疗结束后第1天开始水迷宫测试,通过定位航行实验和空间探索实验,分析益髓解毒法对VD大鼠学习和记忆功能的影响。3.通过对大鼠海马组织HE染色和海马组织透射电镜超微结构观察,分析益髓解毒法对VD大鼠海马病理组织及海马神经元超微结构的干预效果。4.应用Nissl染色和TUNEL(绿色荧光)细胞凋亡检测法,分析益髓解毒法对VD大鼠海马组织内尼氏体及神经元阳性细胞数量和海马组织细胞凋亡的干预作用。5.应用IHC法、Western-blot法、Rt-PCR法检测PI3K/Akt信号通路相关因子PI3K、Akt、p-Akt、Caspase-9、Caspase-3、NF-κB、Bad的蛋白及mRNA表达的变化,分析益髓解毒法对VD大鼠海马组织PI3K/Akt信号通路的调控作用。结果:1.行为学监测结果:在定位航行实验结果中,与假手术组比较,VD模型组大鼠的逃避潜伏期明显延长(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,中药中剂量组和阳性对照大鼠的逃避潜伏期明显缩短(P<0.05,P<0.01),差异具有统计学意义。在空间探索实验中,与假手术比较,VD模型组大鼠首次到达平台的时间明显延长,平台象限停留时间及穿越平台次数明显减少;中药中剂量组大鼠首次到达平台的时间明显缩短,平台象限停留时间及穿越平台次数明显增加,与模型组比较,差异显著(P<0.05,P<0.01)。2.海马病理组织检测结果:HE染色结果:VD大鼠模型组海马组织CA1区的神经元结构欠完整,形态不规则,排列疏松而紊乱,细胞间质水肿明显,细胞核固缩深染,神经元与周围组织间隙增宽,神经元丢失明显。与模型组比较,中药中剂量组大鼠海马CA1区的神经元结构相对完整,形态较规则,层次较清晰,细胞间质水肿不及模型组明显,细胞核固缩减少,神经元与周围组织间隙缩小,神经元可见少量丢失。TEM结果:模型组海马CA1区神经元细胞核形态异常,异染色质增多,细胞器排列紊乱,线粒体结构不完整,有嵴和膜融合现象,空化严重,嵴出现断裂和缺失。与模型组比较,中药中剂量组:神经元结构较完整,胞膜溶解程度较轻,线粒体空化和扩张明显减轻。3.干预海马细胞损伤及凋亡结果:Nissl染色结果:与假手术组比较,VD模型组大鼠海马神经元尼氏小体丢失明显,染色变浅,神经元阳性细胞数目明显减少(P<0.01);与模型组比较,阳性对照组与中药中剂量组神经元胞体内尼氏小体染色明显,神经元阳性细胞数增多(P<0.05,P<0.01),差异具有统计学意义。VD模型组大鼠海马TUNEL法检测凋亡细胞数明显多于假手术组,表明VD过程存在细胞凋亡;中药中剂量组可明显减少凋亡细胞数,与模型组比较,差异显著(P<0.01)。4.调控PI3K/Akt信号通路的相关因子结果:IHC检测结果:与假手术组比较,VD模型组大鼠海马Akt、p-Akt蛋白表达明显减少,Caspase-9、Caspase-3蛋白表达明显增加(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,阳性对照组与中药中剂量组Akt、p-Akt蛋白表达明显增加,Caspase-9、Caspase-3蛋白表达明显减少,差异显著(P<0.05,P<0.01)。WB检测结果显示:与假手术组比较,VD模型组大鼠海马PI3K、Akt、p-Akt、NF-κB蛋白表达明显减少,Caspase-9、Caspase-3、Bad蛋白表达明显增加(P<0.05,P<0.01),两组比较差异显著,具有统计学意义。而中药中剂量组可明显上调PI3K、Akt、p-Akt、NF-κB蛋白表达,下调Caspase-9、Caspase-3、Bad蛋白表达。Rt-PCR结果显示:模型组与假手术组相比,PI3KmRNA、AktmRNA、NF-κBmRNA水平明显降低,Caspase-9mRNA、Caspase-3mRNA、BadmRNA水平明显升高(P<0.05,P<0.01)。中药中剂量组可明显上调PI3KmRNA、AktmRNA、NF-κBmRNA表达,下调Caspase-9mRNA、Caspase-3mRNA、BadmRNA表达。结论:1.益髓解毒法可明显改善VD大鼠的学习和记忆等认知功能。2.益髓解毒法可明显改善VD大鼠海马组织病理结构,保护海马神经元超微结构的完整性,修复神经元损伤。3.益髓解毒法可明显增加VD大鼠海马神经细胞内尼氏小体的数量,修复神经受损功能,抗神经元细胞凋亡。4.益髓解毒法可明显上调大鼠海马组织内PI3K、Akt、p-Akt、NF-κB蛋白和基因表达,下调Caspase-9、Caspase-3、Bad蛋白和基因表达,这可能是益髓解毒法通过调控PI3K/Akt信号通路相关因子表达,以解毒之法解“神经毒”性,抗细胞凋亡,以益髓之法修复神经元损伤,实现脑保护,从而改善VD学习和认知功能,发挥保护VD的作用机制之一。