第一部分腺病毒介导的RNA干扰对癌基因p28GANK细胞生物学功能影响的研究 实验方法： 1.运用T7体外转录法筛选出癌基因p28GANKsiRNA特异性有效片断； 2.将筛选出的有效干扰片断构建到GeneSuppressorTMSystem腺病毒载体内(IMGENEX公司)，包装成腺病毒作进一步的研究； 3.选用高表达癌基因p28GANK的肝细胞癌细胞系HepG2、Hep3B、HuH7、SMMC-7721，运用Real-TimePCR和Westernblot验证腺病毒载体介导的siRNA下调癌基因p28GANK表达的可行性； 4.通过MTT实验和细胞平板克隆形成实验反映癌基因p28GANKRNAi后对四种肝癌细胞以及人的正常原代肝细胞(primarypeoplehepatocytes，PHHs)增殖能力的影响； 5.通过免疫裸鼠荷瘤实验，即将RNAi癌基因p28GANK处理后的细胞注入裸鼠皮下，六周后观察皮下成瘤状况，反映RNAi癌基因p28GANK在体外对肝癌细胞群体增殖能力的影响； 6.细胞流式分析反映RNAi癌基因p28GANK后肝癌细胞的细胞周期变化； 7.Westernblot检测RNAi癌基因p28GANK后Rb1的磷酸化水平和E2F-1的转录活性，以说明癌基因p28GANK调控细胞周期的机理； 8.TUNEL实验和免疫组化DAPI染色反映干扰癌基因p28GANK对肝癌细胞和人正常肝细胞的细胞凋亡影响，并检测HuH7细胞经RNA干扰后caspase-8，caspase-9和caspase-3的表达状态，以深入研究干扰p28GANK引发凋亡的机制； 9.肝癌细胞SMMC-7721经皮下注射建立裸鼠荷瘤模型，用含有干扰癌基因p28GANK片段的腺病毒对瘤体原位皮下多点注射，探索腺病毒介导的RNA干扰p28GANK生物治疗的可行性。 结论：我们成功运用了腺病毒介导的RNA干扰沉默肝癌癌基因p28GANK的表达，并证实p28GANK可作为肝癌生物治疗的新靶标。下调它的表达可抑制肝癌细胞的生长和增殖，并诱发由caspase-8、caspase-9和caspase-3介导的细胞凋亡；减弱Rb1的磷酸化水平并抑制E2F-1的转录活性，阻止细胞进入S期；更为重要的是，原位注射含有干扰p28GANK片段的腺病毒于已荷瘤裸鼠的瘤体内，可诱发肝癌细胞凋亡从而抑制肿瘤的生长。以上结果说明RNAi可以为肿瘤的生物治疗提供一个崭新有效的平台，同时由于p28GANK基因在肝癌中特异性高表达，为肝癌的基因治疗提供了新靶点。 第二部分癌蛋白p28GANK调控NF-κB信号通路新机制的研究研究 实验方法： 1.构建p28GANK、NF-κB各亚基、IκBα、HDAC3等GST融合质粒，含有myc标签和HA标签的p28GANK融合质粒，含有Flag标签的NF-κB融合质粒； 2.运用荧光素酶报告基因系统检测外转p28GANK对NF-κB转录活性的影响，分别用无血清培养、共转RelA/p65及培养24hr后TNF-α刺激不同时相点以提高293T细胞NF-κB本底水平；选p28GANK高表达的HepG2(p53野生型)、Hep3B(p53缺失型)、HuH-7(53点突变型)和Hela(p53野生型)四种肿瘤细胞系，进行腺病毒介导的RNAi24-72hr后，反向观察p28GANK对NF-κB转录活性的影响； 3.通过核抽提、电泳迁移率分析(EMSA)和Suppershift技术，293T细胞瞬转p28GANK后检测NF-κB(RelA/p65，p50)DNA-binding的变化(其间用外转RelA或TNF-α10ng/ml刺激以提高293细胞NF-κB的本底水平)；肿瘤细胞系经腺病毒介导的RNAi后观测DNA-binding的变化； 4.WesternBlot技术及核浆分离检测p28GANK影响NF-κB蛋白水平在胞核胞浆中的分布变化：检测293T细胞瞬转p28GANK后，NF-κB的RelA/p65亚基在胞核胞浆中的分布变化；肿瘤细胞系经腺病毒介导的RNAi后RelA/p65在胞内的分布； 5.间接免疫荧光检测p28GANK对NF-κB细胞内定位的影响：293T细胞共转p28GANK和NF-κB(RelA/p65)后，检测NF-κBRelA/P65在细胞内定位的变化；通过RNAi干扰HepG2内源性的p28GANK后，反向观察细胞内源性NF-κBRelA/p65在细胞内定位的变化； 6.运用免疫共沉淀IP、GST-pulldown和激光共聚焦技术研究p28GANK与NF-κB是否存在直接相互作用，用核阻断剂LepatomycinB(LMB)处理反映p28GANK促使NF-κB出核的分子机制； 7.WesternBlot技术和IKK激酶活性分析293T细胞外转p28GANK和肿瘤细胞下调p28GANK对IκBα磷酸化和表达量的影响，IκBβ蛋白量的变化以及对IKK激酶活性的影响，同时还检测p100/p52表达状况； 8.WesternBlot检测293T细胞外转的p28GANK对TNF-α、LPS、IL-1和紫外线照射等刺激的应答变化； 9.报告基因检测p28GANK对被酰基转移酶p300/CBP酰基化的RelA酰基化状态的影响。 结论：肝癌癌基因p28GANK可抑制NF-κB(RelA/p50，RelA/RelA)二聚体使之滞留于胞浆；抑制NF-κB的转录活性，该作用不依赖于IκB家族蛋白，并且癌基因p28GANK对TNF-α、LPS、IL-1和紫外照射等刺激无应答；肝癌细胞中，高表达的p28GANK直接与NF-κB复合物结合，经核穿梭CRM-1途径加剧该复合物出核，进而抑制了NF-κB的活性。下调肝癌细胞中p28GANK的表达使NF-κB复合物在胞浆中得以释放、游离并重新入核结合靶DNA而活化；下调p28GANK表达的24-72小时内，引起NF-κB转录活性持续性升高，但未见IKK激酶活性升高和IκB家族蛋白表达的变化，也未见p100和p52表达变化，说明此活化过程既不同于经典的IKK激酶激活和IκB降解途径，也不同于非经典的B细胞受体途径，这两条途径都需要经过IKK激酶复合体的活化和26S蛋白酶体降解及加工过程。p28GANK本身为核穿梭蛋白，可入核协同组蛋白去乙酰酶3(HDAC3)促使乙酰化的RelA去酰基化；HDAC3也可结合RelA，故HDAC3可能充当桥梁介导三者间的相互作用，调节RelA的酰基化状况而导致NF-κB复合体出核。综合目前我们的实验结果，我们认为癌基因p28GANK对NF-κB的抑制作用是其信号转导调控机制中新的发现和补充，因此这是一新的调控路径。近来有人报道了另一肝癌癌基因HSCO(HepatomaSubtracted-cDNAlibraryCloneOne)也可直接促使NF-κB出核而抑制其活性，由此抑制p53引发的凋亡，这提示在肝癌信号网络调控中确实存在新的非经典的NF-κB调节途径。癌蛋白p28GANK调控核转录因子NF-κB新机制的研究将有助于我们进一步阐明肝细胞癌发生发展过程中精细分子机制。