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目的:研究益气化瘀补肾中药及其拆方对糖尿病溃疡创面愈合的影响,探讨益气化瘀补肾中药及其拆方调控HIF-VEGF信号转导通路的作用机制。
方法：通过腹腔注射链脲佐菌素和外科方法建立糖尿病大鼠全层皮肤缺损模型,分别观察益气化瘀补肾中药(益气化瘀补肾组)及拆方对照组(益气化瘀组、益气补肾组、补肾化瘀组、益气组、补肾组、化瘀组)、糖尿病溃疡模型组(模型对照组)、正常组各组创面的愈合情况,并应用RT-PCR、免疫组化、图像分析、Westernblot技术从基因和蛋白水平上检测各组创面新生肉芽组织中HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α、VEGF的mRNA含量、蛋白含量,图像分析方法观察成纤维细胞、新生血管的数目变化。
结果：
1.创面愈合情况:术后第7、10、14天正常组创面愈合率明显高于模型对照组(P＜0.01);各用药组创面愈合率高于模型对照组(P＜0.01);益气化瘀补肾组创面愈合率高于各拆方组(P＜0.05,P＜0.01);益气化瘀组、益气补肾组、补肾化瘀组愈合率高于益气组、化瘀组、补肾组(P＜0.05,P＜0.01)。
2.新生血管水平:正常组成纤维细胞数量和微血管计数明显高于模型对照组(P＜0.01);各中药治疗组成纤维细胞数量和微血管计数均高于模型对照组(P＜0.01);益气化瘀补肾组成纤维细胞数量和微血管计数高于各拆方组(P＜0.05,P＜0.01);益气化瘀组、益气补肾组和补肾化瘀组成纤维细胞数量和微血管计数高于益气组、化瘀组、补肾组(P＜0.01)。
3.荧光定量PCR结果:正常组HIF-1α mRNA、HIF-2α mRNA表达水平明显低于模型对照组,VEGF mRNA表达水平高于模型对照组(P＜0.01);各中药治疗组HIF-1α mRNA、HIF-2α mRNA表达水平均低于模型组,VEGF mRNA表达水平高于模型组(P＜0.01);益气化瘀补肾组HIF-1α mRNA、HIF-2α mRNA表达水平低于各拆方组,VEGF mRNA表达水平高于各拆方组(P＜0.05,P＜0.01);益气化瘀组、益气补肾组、补肾化瘀组HIF-1α mRNA、HIF-2α mRNA表达水平低于益气组、化瘀组、补肾组,VEGF mRNA表达水平高于益气组、化瘀组、补肾组(P＜0.05,P＜0.01);补肾化瘀组HIF-1αmRNA、HIF-2α mRNA表达水平低于益气补肾组、益气化瘀组,VEGF mRNA表达水平高于益气补肾组、益气化瘀组(P＜0.05);补肾组HIF-1αmRNA、HIF-2α mRNA表达水平低于化瘀组、益气组,VEGF mRNA表达水平高于化瘀组、益气组(P＜0.05);HIF-3αmRNA表达水平各组差异无统计学意义(P＞0.05)。
4.免疫组化和Western-blot结果:正常组HIF-1α、HIF-2α表达水平明显低于模型对照组,HIF-3α、VEGF表达水平高于模型对照组(P＜0.01);各中药治疗组HIF-1α、HIF-2α表达水平均低于模型组,HIF-3α、VEGF表达水平高于模型组(P＜0.01);益气化瘀补肾组HIF-1α、HIF-2α表达水平低于各拆方组,HIF-3α、VEGF表达水平高于各拆方组(P＜0.01,P＜0.05);益气化瘀组,益气补肾组,补肾化瘀组HIF-1α、HIF-2α表达水平低于益气组、化瘀组、补肾组,HIF-3α、VEGF表达水平高于益气组、化瘀组、补肾组(P＜0.05);补肾化瘀组HIF-1α、HIF-2α表达水平低于益气补肾组、益气化瘀组,HIF-3α、VEGF表达水平高于益气补肾组、益气化瘀组(P＜0.05);补肾组HIF-1α、HIF-2α表达水平低于化瘀组、益气组,HIF-3α、VEGF表达水平高于化瘀组、益气组(P＜0.01,P＜0.05)。
结论：
1.益气化瘀补肾方组和拆方组均能明显提高糖尿病溃疡大鼠创面愈合率,缩短愈合时间,促进创面愈合,其中以益气化瘀补肾方药效果最佳,补肾化瘀组效果好于各拆方组。
2.糖尿病溃疡较正常溃疡难以愈合,其机制可能是HIF-1α、HIF-2α在mRNA和蛋白水平表达升高、VEGF在mRNA和蛋白水平表达降低,同时HIF-3α蛋白水平表达降低,导致局部组织缺血、缺氧,血管生成受阻有关。
3.益气化瘀补肾中药调控HIF-VEGF信号转导通路的机制是通过下调HIF-1α、HIF-2α mRNA和蛋白表达,上调HIF-3α蛋白表达,同时上调VEGF mRNA和蛋白表达来实现的。
4.HIF-3α在mRNA和蛋白表达的差异性,提示益气化瘀补肾方药可能是通过改变HIF-3α蛋白稳定性,促进蛋白降解,直接对蛋白水平产生影响。