背景:原发性肝癌是世界上常见且死亡率较高的肿瘤之一。根据世界卫生组织GLOBOCAN 2008数据统计,每年有748,300人次被检测出罹患肝癌,男性的发病率超过女性的二倍以上,每年有695,900人次死于肝癌。中国每年的新发病例和死亡病例占到全球的一半以上,原发性肝癌是中国第二高发生率和死亡率的肿瘤。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原发性肝癌最主要的病理学类型,占到所有肝癌的75-80%。尽管外科手术切除和肝脏移植是治疗肝癌的主要方法,但是仍然有75%的患者在术后5年内复发和/或转移。这往往是导致患者死亡的主要因素。因此,开展研究肝细胞癌的复查和转移机制显得十分重要。既往研究发现,正常生理情况下,丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1型(serine protease inhibitor Kazal type 1,SPINK1)由胰腺的腺泡细胞分泌,起到抑制胰蛋白酶原过度激活,保护胰腺组织的作用。另一方面,SPINK1也是一种潜在的肿瘤标志物,在卵巢癌、前列腺癌、结直肠癌等肿瘤中表达。血清中SPINK1过表达和肿瘤组织中SPINK1过表达预示着不良预后。基因组学研究发现在遗传性血色素沉着相关的肝癌中SPINK1过度表达。SPINK1的结构较表皮生长因子(EGF)相似,有50%的同源性,与表皮生长因子受体(EGFR)亲和力是EGF的一半。因此,SPINK1被认为在肿瘤的发生发展中可能起到生长因子的作用。所以,本文就SPINK1在肝癌进程中所扮演的角色以及机制展开进一步研究。目的:研究人肝细胞癌中SPINK1的表达与预后的关系,探索SPINK1调控肝癌细胞转移侵袭的分子机制。方法:1、临床收集肝癌根治术患者的组织标本80例,构建组织芯片,免疫组化检测人肝癌组织中SPINK1表达含量,根据染色强度以及染色面积进行评分。结合临床资料以及随访资料,用统计学方法分析肝癌患者肝癌组织中SPINK1表达量、血管侵犯、包膜完整度、肿瘤分化程度、TNM分期、单发/多发病灶间等之间的关系,探究SPINK1与肝细胞癌预后的相关性。2、构建siRNA-SPINK1基因慢病毒载体,鉴定测序正确后,进行病毒的包装和滴度检测并转染MHCC97-H,MHCC97-L细胞,荧光显微镜观察细胞荧光含量,Western blotting鉴定转染前后肝癌细胞中SPINK1蛋白表达以及EMT标志蛋白E-caherin、vimentin表达量。应用Transwell(体外小室迁徙+侵袭)、划痕实验方法检测各组细胞细胞迁移和侵袭能力。3、将人重组SPINK1 蛋白(rSPINK1)10ng/ml加入MHCC97-H,MHCC97-L的培养基中,培养24小时,观察细胞形态变化,Western blotting检测各组细胞SPINK1蛋白表达以及EMT标志蛋白E-caherin及vimentin表达量。应用Transwell(体外小室迁徙+侵袭)、划痕实验方法检测各组细胞细胞迁移和侵袭能力。4、检测筛选信号通路:Western blotting检测MEK/ERK信号通路相关蛋白MEK,p-MEK,ERK,p-ERK在以上各组细胞中表达的变化。5、信号通路抑制剂实验:将U0126(MEK/ERK通路抑制剂)加入rSPINK1处理过的细胞中,Transwell、划痕实验检测再次检测细胞的侵袭力和转移力,观察U0126是否可以抑制了rSPINK1带来的细胞运动能力的增强作用;Western blotting检测相关通路的蛋白水平变化;结合以上实验结果,进一步阐明SPINK1调节肝癌细胞迁移的机制。结果:1、肝癌组织中SPINK1的表达高低与肝癌病理分级、TNM分期、是否存在门脉癌栓的差异有统计学意义。SPINK1高表达组的患者总生存时间低于低表达组,术后复发率高于低表达组。SPINK1表达高低是肝癌患者总生存时间和术后复发率是一个独立风险因素。2、上调肝癌细胞SPINK1蛋白含量可以促进肝癌细胞由上皮细胞表型向间质细胞表型转换(EMT),上皮标志物E-Cadherin表达水平下调,间质标志物vimentin表达上调,同时伴有肝癌细胞转移能力和侵袭能力的增强。抑制肝癌细胞中SPINK1的表达可以抑制肝癌细胞的转移和侵袭能力,同时伴有E-Cadherin上调,vimentin 下调。3、上调肝癌细胞中SPINK1含量激活MEK/ERK信号通路,抑制肝癌细胞中SPINK1的表达可以抑制MEK/ERK信号通路;加入U0126抑制MEK/ERK通路激活,可以抑制SPINK1引起的EMT的相关标志物蛋白含量改变以及对细胞侵袭迁移增强作用。结论:SPINK1高表达是影响肝癌预后的独立危险因素;SPINK1通过MEK/ERK信号转导途径诱导肝癌细胞发生EMT,促进肝癌细胞转移和侵袭。