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目的:通过实验制备CD40单链抗体(CD40 single-chain antibody fragment,CD40ScFv),探讨激动型CD40单链抗体的抗肿瘤作用与其在肿瘤微环境中上调PD-1的表达,为激动性CD40单链抗体联合抗PD-1单克隆抗体治疗肿瘤提供实验基础和理论支持。方法:1、CD40ScFv蛋白的制备:根据本实验室已获得pCANTAB5E-CD40 ScFv噬菌粒,引入双酶切位点,PCR扩增目的基因CD40ScFv,利用定向克隆技术构建pET28a-CD40ScFv重组质粒,将重组质粒转化入Rosetta大肠杆菌,IPTG诱导CD40ScFv蛋白的表达,纯化蛋白并进行蛋白复性和浓缩,BCA测定蛋白含量,SDS-PAGE和Western Blot鉴定所获得的CD40ScFv蛋白。2、CD40ScFv的抗肿瘤作用:构建负荷小鼠乳腺癌4T1细胞的Balb/C小鼠右腋下肿瘤模型,瘤体注射药物进行治疗,根据治疗药物的不同,将荷瘤小鼠分成3组:CD40ScFv组、激动型CD40单克隆抗体组(CD40 monoclonal antibody,CD40mAb)和阴性对照生理盐水(NS)组,观察并记录各组小鼠肿瘤体积的变化。3、CD40ScFv影响肿瘤微环境中PD-1分子表达的实验研究:给予不同治疗后,处死小鼠取瘤体组织,ELISA检测肿瘤组织微环境中INF-γ的浓度,免疫组织化学染色检测肿瘤组织中浸润淋巴细胞PD-1的表达水平。结果:1、成功构建pET28a-CD40ScFv重组质粒,IPTG诱导大肠杆菌表达的CD40ScFv蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定表达成功,分子大小为27KDa左右,经纯化后蛋白浓度为0.562 mg/mL。2、成功构建小鼠乳腺癌模型,针对Balb/C小鼠的乳腺癌4T1细胞分别进行不同治疗后,CD40ScFv组肿瘤大小显著小于NS组,差异具有统计学意义(P<0.05),而与激动型CD40mAb组无明显区别(P>0.05),表明CD40ScFv可以显著抑制肿瘤的生长。3、CD40ScFv组肿瘤组织上清中INF-γ的浓度为(423.25±50.23)pg/mL,显著高于NS组,差异具有统计学意义(P<0.05),而与激动型CD40mAb组相比无明显差异(P>0.05)。4、CD40ScFv组肿瘤微环境中PD-1表达阳性率为8.18%±2.01%,各组间存在显著差异(F=10.624,P<0.005)。CD40ScFv组PD-1的表达水平有着明显上调,相比于NS组具有统计学差异(P<0.005)。而与CD40 mAb组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1、成功构建携带CD40ScFv的pET28a-CD40ScFv重组质粒。重组质粒转化入Rosetta菌后经诱导后可以稳定表达有功能的CD40ScFv蛋白。2、CD40ScFv在体内可以通过激活T淋巴细胞,促使其分泌一些细胞因子如IFN-γ等,发挥抑制肿瘤生长的作用。3、CD40ScFv能够上调肿瘤微环境中浸润淋巴细胞PD-1分子的表达,为其与抗PD-1单克隆抗体联合应用治疗提供了前期实基础。