丝氨酸蛋白酶(serine protease,SP)是生物界中最大的水解酶家族,包括凝血酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶等,它们都含有三个关键氨基酸残基——丝氨酸、组氨酸和天冬氦酸(Ser、His、Asp)构成的活性中心,具有类似的水解作用机制。丝氨酸蛋白酶在生物体内主要参与食物的消化和吸收,在血液凝固、免疫反应、信号传导、细胞分化等多种生理生化过程中也起到重要作用。现有证据表明丝氨酸蛋白酶还在昆虫体内对Bt原毒素的活化和毒素降解中起着重要的作用。Bt原毒素被昆虫取食后,在丝氨酸蛋白酶的作用下溶解并水解成活化毒素,进一步与中肠受体特异性结合,造成中肠细胞膜穿孔、膜内外离子失衡等一系列生理破坏作用,因此丝氨酸蛋白酶的变化也可能是昆虫对Bt毒素产生抗性的重要因素之一。胰蛋白酶缺失以及中肠丝氨酸蛋白酶总活性降低使其对原毒素活化作用不充分,胰凝乳蛋白酶表达量上调后对活化毒素的过度降解,已经证实是昆虫对Bt毒素产生抗性的两个重要原因。但是,哪些丝氨酸蛋白酶参与原毒素的活化,哪些介导毒素的降解等尚不清楚。随着异源蛋白功能表达技术的日渐成熟,利用体外表达产物来直接进行与底物互作的研究成为了可能。本研究选取了分别作为胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶及其类似物代表的棉铃虫丝氨酸蛋白酶基因HaSP3、HaSP6、HaSP24、先明确其在棉铃虫不同发育阶段和组织部位的表达情况,再通过比较优化了不同宿主、融合标签、诱导温度及时间等原核表达条件,将这3个基因成功体外表达,检测到蛋白酶HaSP3及HaSP6表达产物的生物活性,并发现蛋白酶HaSP3表达产物对CrylAc原毒素具有一定的降解作用。本研究结果为后期大量表达棉铃虫丝氨酸蛋白酶基因搭建了较好的技术平台,为深入探索不同蛋白酶和毒素之间的互作机制奠定了基础。1.棉铃虫丝氨酸蛋白酶HaSP3、HaSP6、HaSP24的氨基酸序列结构分析本实验室前期研究发现,棉铃虫CrylAc抗性品系SCD423中胰蛋白酶HaSP6、胰凝乳蛋白酶HaSP3及丝氨酸蛋白酶类似物HaSP24的基因相对表达量比敏感品系SCD分别上调了 2倍、1.43倍和4.6倍。由于蛋白酶催化效率极高,少量倍数的蛋白酶表达很可能对抗性的形成具有一定作用,因此本研究选取了这三种蛋白酶,并与其他五种丝氨酸蛋白酶序列进行了结构分析。HaSP6、HaSP3作为典型的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶,都具有His、Asp、Ser关键残基以及六个半胱氨酸(Cys)构成的3个二硫键。而HaSP24虽具有六个半胱氨酸构成的二硫键,但关键催化域中的His被Phe取代,属于丝氨酸蛋白酶类似物。2.蛋白酶基因HaSP3、HaSP6、HaSP24在棉铃虫不同发育阶段及组织部位表达分析采用实时荧光定量PCR分别对蛋白酶基因HaSP3、HaSP6、HaSP24在棉铃虫8个不同发育阶段及5个不同组织部位的表达进行了研究。蛋白酶基因HaSP3、HaSP6、HaSP24在棉铃虫卵、蛹、成虫中的表达量都很低,且雌雄个体差异不大。HaSP3、HaSP6在幼虫2龄时表达水平最高,分别为卵表达量的1800、1000多倍。HaSP24则在5龄时表达水平最高,为卵表达量的4000多倍。对在肠道、肠道以外组织、前肠、中肠、后肠等不同部位的表达情况分析表明,蛋白酶基因HaSP3、HaSP6、HaSP24在肠道、前肠、中肠部位的表达水平较高,其它部位都很低;其中,HaSP3、HaSP6、HaSP24在前肠的表达量分别为整个肠道的9.44、1.97、3.65倍。3.蛋白酶HaSP3的原核表达条件优化影响原核表达效率的因素众多,如宿主菌的使用、标签的选择、诱导温度及时间、培养基的成分等。本文比较了宿主菌BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、TransB(DE3)对蛋白酶HaSP3的表达情况,发现BL21(DE3)宿主菌更有利于目的基因的可溶表达;比较了含不同标签的pET30a、pET32a、pET41a载体,结果显示采用融合His及Gst标签的pET41a可以将目的蛋白包涵体形式降至最低;还比较了不同诱导温度、时间对重组蛋白HaSP3(rHaSP3)表达的影响。最终证实采用pET41a载体在宿主菌BL21(DE3)中16°℃低温诱导22小时能够产生较多可溶蛋白rHaSP3,且达到最大饱和量。4.蛋白酶HaSP3、HaSP6、HaSP24原核表达、活性测定及对CrylAc原毒素的酶解对rHaSP3、rHaSP6(重组蛋白HaSP6)、rHaSP24(重组蛋白HaSP24)蛋白进行原核表达,经Gst柱、离子交换柱纯化后,除发现目的蛋白条带外,在约60 KDa处还有一条蛋白条带,LC-MS/MS质谱定为分子伴侣蛋白(GroEL)。重组蛋白表达纯化后,经肠激酶酶切后,检测到HaSP3、HaSP6蛋白酶表达产物分别对胰凝乳蛋白酶底物(SAAPFpNA)、胰蛋白酶底物(BApNA)表现出活性,为 182.1×10-3、140.7×10-3 mU/min/mg,而丝氨酸蛋白酶类似物HaSP24表达产物未检测到活性。将经过肠激酶酶切后的蛋白酶HaSP3表达产物对CrylAc原毒素酶解60 min后,原毒素条带明显发生变化,但在65 KDa处并没有发现活化毒素条带,说明蛋白酶HaSP3能够在一定程度上参与CrylAc原毒素的活化,将其水解成活化毒素可能需要更高纯度、更高浓度的蛋白酶HaSP3或者需要多个蛋白酶协同作用。