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目的骨髓基质干细胞是一种多能干细胞,它具有向成骨细胞和脂肪细胞相似的分化潜能,其“成骨-成脂”分化平衡一旦被打破可能会导致多种代谢疾病的发生,例如骨质疏松和骨硬化病等。骨髓基质干细胞分化调控涉及多个基因和信号通路。近年来研究证实部分核因子I(Nuclear Factor I,NFI)家族成员对骨代谢有调节作用,但NFIB对于骨代谢是否有影响及其作用机制尚不明确。本研究选取转录因子NFIB(Nuclear Factor I/B)作为研究对象,分别从分化调节功能和分子机制以及在体作用三个方面进行深入探讨。方法1.利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)技术检测小鼠各组织中Nfib的表达水平;培养骨髓基质细胞系ST2和小鼠原代骨髓基质干细胞,进行成脂/成骨诱导之后分别检测Nfib在分化过程中随时间变化的m RNA表达差异。在间充质干细胞系C3H10T1/2、骨髓基质干细胞系ST2、前脂肪细胞系3T3-L1和成骨前体细胞系MC3T3-E1中过表达或敲减Nfib,通过q RT-PCR及蛋白质免疫印迹实验(Western blotting,WB)检测成脂和成骨诱导后相关基因的m RNA和蛋白水平的变化,利用油红O染色(oil red O staining)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色观察细胞分化状态的变化。构建Nfib敲减慢病毒,感染小鼠原代骨髓基质干细胞和ST2后观察Nfib表达变化对细胞分化的影响。2.通过q RT-PCR和WB实验筛选Nfib下游靶基因。并通过免疫荧光、双荧光素酶报告基因实验及染色质免疫共沉淀技术(Chromatin immunoprecipitation,Ch IP)进一步确认NFIB调控靶基因的分子机制。通过获得/缺失性实验验证靶基因在骨髓基质细胞分化调控中的功能。进行阻断实验观察NFIB调节成脂/成骨分化的作用是否由于靶基因敲减而被阻断。3.构建高脂饮食诱导的小鼠肥胖模型,尾静脉注射Nfib敲减慢病毒Nfib-sh RNA LV,观测体重,检测小鼠总胆固醇、游离脂肪酸和葡萄糖等血清糖脂代谢指标,HE染色分析脂肪组织的变化。构建切除双侧卵巢的小鼠模型,而后胫骨骨髓腔注射Nfib si RNA进行体内转染,一个月后取胫骨制作石蜡切片,HE染色后观察脂肪细胞变化。结果1.检测到Nfib在小鼠不同组织中表达量不同,在骨骼肌、心、骨、肝、肾、脂肪和脑等组织高表达,在小肠、结肠、胃和脾等组织低表达。在小鼠原代骨髓基质干细胞和ST2细胞中,Nfib在成脂诱导后表达先上升后下降,分别在2d和3d达到顶峰;而在成骨诱导后,早期Nfib表达下降或不变,后逐渐升高,在8d达到顶峰。在ST2细胞和C3H10T1/2细胞中过表达Nfib后促进细胞成脂分化,成脂分化相关基因的表达上升;在3T3-L1细胞中过表达Nfib后促进细胞脂肪合成,脂合成相关基因表达上升;在ST2细胞和MC3T3-E1细胞中过表达Nfib后抑制细胞成骨分化,成骨分化相关基因表达下降;反之敲减Nfib则抑制细胞成脂分化,抑制细胞脂合成,促进细胞的成骨分化。感染敲减慢病毒并进行诱导后,小鼠原代骨髓基质干细胞和ST2细胞成脂分化减弱,成骨分化增强。2.利用si RNA降低Nfib表达后,分泌型卷曲相关蛋白4(Secreted frizzled-related protein 4,Sfrp4)的m RNA和蛋白水平下降。免疫荧光实验结果显示过表达Nfib阻止了Wnt3a引起的β-catenin的核转运。WB结果表明过表达Nfib后核蛋白中β-catenin和TCF7L2表达降低。双荧光素酶报告基因实验和Ch IP实验证明NFIB可以通过与Sfrp4启动子区特异性结合促进其转录。功能研究表明SFRP4抑制成骨分化而促进成脂分化。阻断实验证实降低Sfrp4表达能减弱NFIB调控骨髓基质干细胞定向分化的能力。3.尾静脉注射Nfib-sh RNA LV缓解了小鼠由于高脂喂养导致的体重增加,抑制了脂肪细胞体积的增大,降低了血清中游离脂肪酸、总胆固醇和葡萄糖等糖脂代谢指标的水平。构建切除双侧卵巢的小鼠模型,利用胫骨骨髓腔注射进行Nfib si RNA体内转染后,4周后去卵巢小鼠骨髓腔内脂肪细胞数量显著减少。结论1.NFIB能够促进骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化,抑制其成骨分化;2.NFIB通过直接与Sfrp4基因启动子区结合而激活Sfrp4基因转录进而抑制Wnt/β-catenin信号通路活性,从而减少骨髓基质干细胞的成骨分化,而促进其成脂分化。3.Nfib-sh RNA LV能抑制小鼠高脂饮食导致的肥胖,缓解肥胖相关的糖脂代谢紊乱。降低Nfib表达能够抑制去卵巢小鼠骨髓腔中脂肪的积累。