论文部分内容阅读
目的:骨再生是一个在人体生长发育各个阶段均保持高度动态的骨重塑过程。成骨细胞之间的相互作用产生新骨,破骨细胞吸收旧骨,两者保持动态平衡。传统的骨缺损治疗往往受限于自体骨的供应不足、异体骨移植的免疫排斥反应和高昂的医疗费用。近年来,结构简单、体积小、组织通透性高、生物相容性好的新型荧光碳点受到了研究者的广泛关注。碳点作为一种新型纳米材料具有巨大生物医学应用潜力,但其在骨再生领域的应用有待探讨。我们已经合成了新型锌离子修饰碳点（Zn-CDs）,发现其在体外具有良好的成骨活性,但其促进成骨细胞分化的最佳剂量、相关因素以及体内骨再生情况仍不清楚。本实验通过研究Zn-CDs对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖、分化的影响以及Zn-CDs对大鼠颅骨缺损的修复效果,以期明确Zn-CDs促进干细胞成骨分化的最佳剂量和相关因素以及Zn-CDs体内促骨再生的能力,为Zn-CDs的进一步临床应用提供良好的理论基础。方法:利用葡萄糖酸锌（Zn-G）一步热解法制备Zn2+修饰碳点（Zn-CDs）,采用透射电镜（TEM）和高分辨透射电镜（HRTEM）观察Zn-CDs的形貌;通过光致发光光谱和紫外-可见吸收光谱来测定Zn-CDs的光学性质;采用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和X射线光电子光谱（XPS）分析Zn-CDs的化学结构和表面官能团,综合表征结果验证Zn-CDs的合成。体外分离培养BMSCs,通过MTS法检验Zn-CDs的生物安全性以及其对BMSCs的增殖的影响。通过细胞内活性氧（ROS）、碱性磷酸酶（ALP）活性、茜素红染色一系列成骨相关测定,确定Zn-CDs体外诱导BMSCs成骨分化的情况。综合分析明确Zn-CDs促进干细胞成骨分化的最佳剂量与相关因素。进行Zn-CDs改性明胶/羟基磷灰石（GH）纳米纤维支架促进骨再生动物实验研究。通过静电纺丝技术制备明胶/羟基磷灰石（GH）纳米纤维支架,通过扫描电子显微镜（SEM）对支架的表面形态进行研究。利用Zn-CDs自发荧光的性质,采用倒置荧光显微镜验证Zn-CDs的成功负载。选用10只6周龄雄性SD大鼠（体重200 g）,建立缺损直径为5mm的大鼠颅骨缺损模型,并随机分为两组（GH组和Zn-CDs/GH组）,植入支架。采用CBCT及HE染色评价术后8周大鼠颅骨骨缺损修复情况。结果:TEM、FT-IR、XPS等结果表明Zn-CDs成功合成。MTS结果显示葡萄糖酸锌（Zn-G）和Zn-CDs锌离子浓度分别是10-44 mol/L（Zn-G:45.6μg/ml）和10-55 mol/L（Zn-CDs:300μg/ml）或以下时,能够促进骨髓间充质干细胞的增殖。在成骨能力方面,Zn-CDs诱导的ALP活性明显高于Zn-G,并且茜素红染色显示Zn-CDs组钙结节面积呈剂量依赖性增加;在相同Zn2+浓度(10-5mol/L)下,Zn-CDs组的钙结节数量明显多于Zn-G组。Zn-CDs/GH支架的PL光谱以及显微镜下的荧光激发展现出与Zn-CDs一样的激发依赖的特征,表明Zn-CDs在GH支架上的负载。动物实验CBCT影像学结果表明Zn-CDs/GH组较对照组明显的骨缺损修复效果,定量分析显示Zn-CDs/GH组新骨形成体积（6.66±1.25 mm3）是对照组（3.33±0.94 mm3）的两倍。HE染色组织学结果也进一步表明Zn-CDs/GH组在8周时出现了明显的新骨形成。结论:1.锌含量是影响Zn-CDs生物相容性和成骨能力的重要因素。含10-5mol/l Zn2+的Zn-CDs溶液是体外培养BMSCs增殖和分化的最佳浓度。2.Zn-CDs可以有效地促进骨再生。Zn-CDs/GH复合材料能达到理想的骨缺损修复效果,Zn-CDs具有良好的成骨以及骨诱导活性,在骨病和骨组织再生方面有应用前景。