Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)具有较强的抗病毒活性,并在机体对抗病毒感染中发挥举足轻重的作用。病毒感染机体后,其保守的病原相关分子模式可被Toll样受体(Toll like receptors)、维甲酸诱导基因Ⅰ受体RIG-Ⅰ-like receptors, RLRs)等模式识别受体(Pattern-recognition receptors, PRRs)所识别,通过一系列信号转导,最终激活免疫细胞释放Ⅰ型干扰素及促炎症细胞因子,从而发挥抗病毒作用。蛋白的泛素化作用在RIG-Ⅰ受体的活化和抗病毒免疫反应中起着至关重要的调节作用。然而,与RIG-Ⅰ活化相关的去泛素化作用的功能尚不明确。我们研究发现,泛素特异性蛋白酶(Ubiquitin-specific protease4, USP4)可以通过其去泛素化酶活性来调节RIG-Ⅰ的表达和活化。病毒感染诱导RIG-Ⅰ激活后,USP4的表达明显降低。而USP4的过表达能够显著增强RIG-Ⅰ的表达并上调其活化诱导的IFN-β的释放,同时抑制水泡口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV)的复制增殖。而用siRNA干扰USP4表达后会得到相反的结果。另外,USP4可以与RIG-Ⅰ直接相互作用并特异性去除其K48偶联的泛素链。因此,我们提出,USP4作为RIG-Ⅰ的一个新的调节分子,通过其去泛素化酶活性去除RIG-Ⅰ K48偶联的泛素链来稳定RIG-Ⅰ的表达,从而正向调节其下游信号通路。研究目的：1、闸明USP4在RIG-Ⅰ信号通路中的功能；2、找出USP4的作用靶点及机制；3、探讨USP4在细胞抗病毒反应中的作用。研究方法：1、在不同细胞中检测RIG-Ⅰ的活化对USP4的表达的影响。1.1、在Hela细胞中检测RIG-Ⅰ活化对USP4表达的影响。a.Ⅰ在Hela细胞中转染poly(I:C)0,2,4,8,12h,RT-PCR检测USP4的表达(mRNA水平)；Ⅱ在Hela细胞中转染poly(I:C)0,12,24,36h,Western blot检测USP4的表达(蛋白水平)。b.Ⅰ用SeV(Sendai virus,仙台病毒)刺激Hela细胞0,8,12,24h,RT-PCR检测USP4的表达(mRNA水平)；Ⅱ用SeV刺激Hela细胞0,8,12,24,36h,Western blot检测USP4的表达(蛋白水平)。1.2在小鼠原代腹腔巨噬细胞中检测RIG-Ⅰ活化对USP4表达的影响。提取小鼠原代腹腔巨噬细胞,ⅠSeV刺激0,4,8,12,24h,RT-PCR检测USP4的表达(mRNA水平)；ⅡSeV刺激0,12,24,36h,Western blot检测USP4的表达(蛋白水平)。2、表达变化的USP4对RIG-Ⅰ介导的IFN-β表达的影响。2.1mRNA水平检测表达变化的USP4对RIG-Ⅰ介导的IFN-β表达的影响。a.在HEK293细胞中分别转染空白质粒或USP4的高表达质粒24h后,再分别转染poly(I:C)或poly(dA:dT)12h,RT-PCR检测IFN-β的表达。b.Ⅰ在HEK293或Hela细胞中分别转染Ctrl siRN八或USI’4siRNA36h后,再转染poly(I:C)0,4h,811,RT-PCR检测IFN-β的表达。Ⅱ在HEK293或Hela细胞中分别转染Ctrl siRN八或USP4siRNA36h后,再转染poly(dA:dT)0,16h,RT-PCR检测IFN-β的表达。Ⅲ在Hela细胞中分别转染Ctrl siRN八或USP4siRNA36h后,SeV刺激0,12h,RT-PCR检测IFN-β的表达。2.2检测表达变化的USP4对RIG-Ⅰ介导的IFN-β和IRF3报告基因活性的影响。a.在Hela细胞中分别共转染空白质粒或USP4的高表达质粒和IFN-β、IRF3的报告基因质粒,SeV刺激12h后检测报告基因活性差异。b.在Hela细胞中分别转染Ctrl siRNA或USP4siRNA,再分别转染IFN-β、 IRF3的报告基因质粒,SeV刺激12h后检测报告基因活性差异。3、确定USP4的作用靶点。3.1mRNA水平检测表达变化的USP4对RIG-Ⅰ信号通路中各接头分子介导的IFN-β表达的影响。a.在HEK293细胞中分别共转染空白质粒或USP4的高表达质粒和RIG-Ⅰ， MAVS, TBK1, IRF35D, TRIF, IKK-ε, MDA5的表达质粒24h, RT-PCR检测IFN-β的表达。b.在HEK293细胞中分别转染Ctrl siRNA或USP4siRNA24h后,再分别转染RIG-Ⅰ, MAVS, TBK1, IRF35D, MDA5的表达质粒24h, RT-PCR检测IFN-β的表达。c.在Huh7.5细胞中分别共转染空白质粒或USP4的高表达质粒和RIG-I,MAVS,TBK1,IRF35D的表达质粒24h,RT-PCR检测IFN-β的表达。3.2检测USP4高表达对RIG-I信号通路中各接头分子介导的IFN-β和IRF3报告基因活性的影响。在HEK293细胞中分别共转染空白质粒或USP4的高表达质粒和TRIF, RIG-Ⅰ, MAVS, TBK1, IRF35D的表达质粒与IFN-β、IRF3的报告基因质粒,24h后检测报告基因活性差异。3.3蛋白水平检测表达变化的USP4对各接头分子表达的影响。a.在HEK293细胞中分别共转染不同剂量的空白质粒或USP4的高表达质粒和RIG-Ⅰ, MAVS, STING TBK1, IRF3, IKK-ε, MDA5的表达质粒,Western Blot检测各接头分子的表达情况。b.在Hela细胞中分别转染Ctrl siRNA或USP4siRNA36h, Western Blot检测内源性的RIG-Ⅰ, MAVS和TBK1的表达情况。4、USP4调控RIG-I信号通路的分子机制研究。4.1根据前面的结果,免疫共沉淀明确USP4与RIG-Ⅰ、MAVS、TBK1等相关靶分子的结合情况。a.在HEK293细胞中分别共转染带有Myc标签的USP4质粒和带有Flag标签的RIG-Ⅰ、MAVS等质粒,分别用相应抗体进行免疫沉淀检测其相互结合情况。b.在Hela细胞中转染poly(I:C)0,8,12h,免疫沉淀结合Western Blot检测内源性的USP4与RIG-Ⅰ、MAVS等信号分子的结合情况。c.在HEK293细胞中分别共转染USP4各节段质粒和RIG-Ⅰ、MAVS等质粒,免疫共沉淀检测各节段与靶分子的结合情况,明确USP4与靶分子结合的结构域。4.2USP4对相应靶分子泛素化的影响。a.靶分子表达质粒、USP4表达质粒或空白质粒分别与泛素质粒共转染HEK293细胞,免疫共沉淀结合Western Blot检测USP4对靶分子泛素化的影响。b.靶分子表达质粒、USP4表达质粒或空白质粒分别与泛素质粒野生型或突变体(K48突变体、K63突变体)共转染HEK293细胞,免疫共沉淀结合Western Blot检测USP4对靶分子泛素化形成(K48或K63)的影响。c.在HEK293细胞中分别共转染Ctrl siRNA或USP4siRNA后,再共转染靶分子表达质粒和泛素质粒野生型或突变体(K48突变体、K63突变体),免疫共沉淀结合Western Blot检测USP4对靶分子泛素化形式(K48或K63)的影响。d.在Hela细胞中分别转染Ctrl siRNA或USP4siRNA, SeV刺激4h后,免疫共沉淀结合Western Blot检测USP4对内源性靶分子泛素化的影响,同时明确泛素化形式(K48或K63)。5、USP4在抗病毒感染中的功能研究。a.在HEK293细胞中分别转染空白质粒或USP4的高表达质粒24h后,用VSV感染细胞,检测VSV的复制情况。(空斑形成实验检测病毒滴度；实时定量PCR检测细胞中VSV mRNA)b.在HEK293细胞中分别共转染Ctrl siRNA或USP4siRNA48h后,用VSV感染细胞,检测VSV的复制情况。(空斑形成实验检测病毒滴度,实时定量PCR检测细胞中VSV mRNA)研究结果：1、RIG-Ⅰ信号通路的活化能够抑制USP4的表达。a.用poly(I:C)转染或SeV刺激Hela细胞以激活RIG-Ⅰ信号通路后,USP4的表达被明显抑制(mRNA水平和蛋白水平)。b.用SeV刺激小鼠原代腹腔巨噬细胞,USP4的表达也明显降低(mRNA水平和蛋白水平)。2、USP4可以显著增强RIG-Ⅰ介导的IFN-β的表达。a.在HEK293细胞中转染USP4的高表达质粒后,转染poly(I:C)或poly(dA：dT)(活化RIG-Ⅰ信号通路)诱导的IFN-β表达明显上调。b.特异性小干扰RNA抑制HEK293细胞或Hela细胞中内源性USP4的表达,转染poly(I:C)或poly(dA:dT)诱导的IFN-β表达被明显抑制。c.特异性小干扰RNA抑制Hela细胞中内源性USP4的表达,可显著抑制SeV诱导的IFN-β的表达。d.在Hela细胞中,USP4的高表达可明显增强SeV介导的IFN-β和IRF3报告基因的活化；特异性小干扰RNA抑制USP4的表达后,SeV介导的IFN-β和IRF3报告基因活化被显著抑制。3、USP4靶向作用于RIG-Ⅰ。3.1USP4特异性调控RIG-Ⅰ介导的IFN-β表达(mRNA水平)。a.USP4的过表达可明显增强HEK293细胞中RIG-Ⅰ介导的IFN-β表达(mRNA水平),而对其下游信号分子MAVS, STING, TBK1和接头蛋白MDA5介导的IFN-β的表达无明显影响。在RIG-Ⅰ缺陷的Huh7.5细胞中结果类似。b.特异性小干扰RNA抑制HEK293细胞中内源性USP4的表达,可显著抑制RIG-Ⅰ介导的IFN-β表达(mRNA水平),但对其下游信号分子MAVS, STING, TBK1, IRF3, IKK-ε和接头蛋白MDA5介导的IFN-β的表达作用不大。3.2USP4特异性调控RIG-Ⅰ介导IFN-β及IRF3的报告基因活化。USP4的过表达可明显增强HEK293细胞中RIG-Ⅰ介导的IFN-β及IRF3的报告基因活化,而对其下游信号分子MAVS，TBK1，IRF3及接头分子TRIF介导的IFN-β及IRF3的报告基因活化无明显作用。3.3USP4特异性增强RIG-Ⅰ的表达。a.在HEK293细胞中,USP4的过表达能够显著上调外源性RIG-Ⅰ的表达,且具有剂量依赖性；而对于外源性MAVS,STING、TBK1,IRF3,IKK-ε, MDA5的表达无明显影响。b.特异性小干扰RNA抑制Hela细胞中内源性USP4的表达,可显著并抑制内源性RIG-Ⅰ的表达,而对内源州MAVS.TBK1的表达无明显作用。4.USP4可以特异性与RIG-Ⅰ相结合。4.1USP4可以与RIG-Ⅰ相互结合。a.在HEK293细胞中共转染带有不同标签的USP4和RIG-Ⅰ的表达质粒,分别用相应抗体进行免疫共沉淀,Western Blot的结果显示,外源性的USP4和RIG-Ⅰ可以相互结合。b.在Hela细胞中，转染poly(I:C)不同的时间点后,用内源性的抗体进行免疫共沉淀,Western Blot的结果显示,内源性的USP4和RIG-Ⅰ能够组成性结合。4.2USP4特异性结合于RIG-Ⅰ的N末端Card结构域。在HEK293细胞中分别共转染空白质粒或USP4表达质粒与RIG-Ⅰ仅有N末端两个Card结构域的质粒RIG-IN,Western Blot的结果显示,USP4的过表达可以显著增强RIG-IN的表达；免疫共沉淀结果表明,USP4可以直接与RIG-IN相结合。4.3USP4与RIG-Ⅰ的结合位点位于其N末端的DUSP结构域。在HEK293细胞中分别共转染USP4的不同节段质粒(WT，野生型；N260,C末端USP结构域缺失：C261,N末端DUSP结构域缺失)与RIG-Ⅰ表达质粒,免疫共沉淀结果表明,RIG-Ⅰ与WT,N260可以相结合,但是与C261末检测到结合。5.USP4可以特异性移除RIG-Ⅰ的K48-偶联的泛素链。5.1USP4的过表达可特异性下调RIG-ⅠK48-偶联的体外泛素化作用。a. RIG-Ⅰ表达质粒、USP4表达质粒或空白质粒分别与泛素粒共转染HEK293细胞,免疫共沉淀结果表明,USP4过表达能明显下调RIG-Ⅰ的体外泛素化作用。b. RIG-Ⅰ表达质粒、USP4表达质粒或空白质粒分别与泛素质粒野生型或突变体(K48突变体、K63突变体)共转染HEK293细胞,免疫共沉淀结果显示,USP4过表达可特异性下调RIG-Ⅰ的K48偶联的泛素化。同时,USP4对于MAVS的体外泛素化作用无明显影响。5.2特异性小干扰RNA抑制HEK293细胞中内源性USP4的表达,可显著上调RIG-ⅠK48-偶联的体外泛素化作用。a.在HEK293细胞中分别共转染Ctrl siRNA或USP4siRNA后,再共转染RIG-I表达质粒和泛素质粒野生型或突变体(K48突变体、K63突变体),免疫共沉淀结果显示,USP4的低表达能特异性增强RIG-Ⅰ K48-偶联的体外泛素化作用。b.小干扰RNA抑制Hela细胞中内源性USP4的表达,可显著上调SeV刺激诱导的RIG-Ⅰ内源性泛素化作用,同时其K48-偶联的泛素化作用也明显增强。6.USP4参与细胞抗病毒反应。USP4的过表达能明显抑制VSV病毒在HEK293细胞中的复制；而用小干扰RNA抑制内源性USP4的表达后能显著促进VSV病毒在胞内的复制。结论：1、RIG-Ⅰ信号通路的活化能够抑制USP4的表达。2、USP4能特异性增强RIG-Ⅰ介导的IFN-β的表达。3、USP4可以与RIG-β相结合并通过去泛素化酶活性去除其K48-偶联的泛素链来稳定RIG-β的表达,从而正向调节其下游信号通路。4、USP4参与细胞抗病毒反应。创新点及意义：1、本研究首次提出,USP4作为RIG-Ⅰ的一个新的调节分子,通过其去泛素化酶活性去除RIG-Ⅰ K48偶联的泛素链来稳定RIG-Ⅰ的表达,从而正向调节其下游信号通路。2、本研究为正向调控RLR信号通路提供新的实验证据，为抗病毒研究、诊断和治疗提供新的思路。