论文部分内容阅读
研究背景及目的:急性冠脉综合征（ACS）仍是目前死亡率和发病率很高的疾病,即使在治疗方面取得长足的进步[1]。急性冠脉综合征是不稳定的冠脉动脉粥样斑块由于多种原因导致的破裂激活了内源性凝血途径和活化血小板,形成的血栓阻断或减少冠脉动脉血流而引起的一系列的临床综合征。研究显示动脉粥样硬化斑块的稳定性与结构构成远远比冠脉动脉的狭窄程度更能影响心肌梗死的发生及预后,大于68.5%的心肌梗死是由不稳定斑块（vulnerable plaque）破裂引起[3]。研究发现[11],冠状动脉粥样硬化斑块的稳定与否是其含有的巨噬细胞多少呈正相关性,不稳定动脉粥样硬化斑块中大量巨噬细胞浸润,而稳定的动脉粥样斑块中只有少量巨噬细胞浸润。巨噬细胞激活分泌的各种细胞因子,引起慢性炎症,减弱了斑块稳定性。因此,如何稳定减少不稳定斑块的形成,减轻巨噬细胞的炎性作用,促进斑块的稳定已经引起国内外学者的高度重视。大量实验已表明,蛋白水解酶活性在正常的动脉组织内无活性,但在不稳定粥样斑块内,基质金属蛋白酶等蛋白水解酶的活性显著提高,激活的蛋白酶降解了组成粥样斑块斑块纤维帽细胞外基质,导致了纤维帽变薄、强度变小,造成斑块破裂[12,13]。CD147,亦称Emmprin（细胞外基质金属蛋白酶诱导因子）,是促进基质金属蛋白酶的主要细胞因子,其通过多种细胞通路促进MMPs的分泌[14]。如何减少斑块中巨噬细胞分泌MMP,促进易损斑块的稳定已引起国内外学者的广泛关注。粘着斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）是位于胞质内的一种非受体蛋白酪氨酸激酶,其作为胞内外信号转导的中枢,接收来自胞外的许多信号后（主要包括细胞粘附、营养、压力等信号）调控细胞的增殖、代谢等多方面的功能[15]。Wu,Hao[16]等发现在肝癌细胞中可溶性的CD147可以促进MMP-2表达上升,并且与此同时上升有pFAK,并认为FAK可能是促进MMP表达的的一个新路径。鉴于FAK普遍在机体各系统、器官、组织和细胞中有表达,因此,我们推测FAK在巨噬细胞有功能表达,并可能参与MMP的诱导表达。此实验以THP-1巨噬细胞为模型,探讨粘着斑激酶（FAK,focal adhesion kinase）在CD147诱导THP-1源巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶9（MMP9）过程中的作用及以及寻找预防急性冠脉综合征（ACS,acute coronary syndrome）潜在靶点。为了在CD147刺激后观察FAK与MMP9的基因表达和蛋白表达的峰值,巨噬细胞分为5组（0h,3h,6h,9h,12h）,0h作为对照组。采用qRT-PCR及Western blot技术检测FAK及MMP9的转录及翻译水平。另外,为了确定pFAK在CD147产生MMP9的作用,我们加入了FAK inhibitor 14抑制pFAK 9h后的后观察FAK,pFAK和MMP9的蛋白表达水平。方法:1.THP-1（人单核细胞株）用含血清培养基（含10%澳洲胎牛血清、RPMI 1640、青链霉素）在37℃、5%CO2恒温培养箱中传代培养后,离心后用无血清培养基（RPMI1640、青链霉素）将细胞浓度调至106/ml,每孔1ml接种到6孔板中,用5ng/ml的佛波酯（Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA）刺激48小时后分化成为的巨噬细胞模型。更换含血清培养基,恢复巨噬细胞活力。2.qRT-PCR:加入1ml的Trizol裂解细胞,加入0.2ml的氯仿溶解有机物,离心后将含有RNA的水相转至新管中,加入等量的70%乙醇,倒入吸附柱中,反复加入去蛋白液、漂洗液去除蛋白和乙醇后,用RNase free water从吸附柱中提取RNA。以Oligo dT Primer及Random 6 mers进行cDNA的合成,使用基因FAK,MMP-9,GAPDH进行PCR扩増的引物序列分别为:FAK:上游5’-TGGTGCAATGGAGCGAGTATT-3’,下游5’-CAGTGAACCTCCTCTGACCG-3’;MMP9:上游5’-TCGTCATCGTCGAAAT GGGC-3’,下游5’-GGGACGCAGACATCGTCATC-3’;GAPDH（内参）上游:TCGG AGTCAACGGATTTGGT-3’,下游:5’-TTGCCATGGGTGGAATCATA-3’。使用Bio-RAD PCR热循环仪进行qRT-PCR。基因表达用SYBR Green 1荧光定量PCR在（PCR机器）上进行监测,结果用该仪器进行分析,结果重复3次。3.Western Blot用4℃预冷的RIPA裂解液（含pH 8.0 20mmol/L Tris-HCL,150mmol/L Na Cl,1%NP-40,0.5%deoxycholate,0.1%SDS,1mmol/L EDTA,10mg/L亮抑蛋白酶肽,2mg/L胰蛋白酶抑制剂,1mmol/L苯甲基苯磺酰氟）裂解细胞,冰上裂解10min,在4℃下,离心半径为10cm,12000r/min高速离心10min,收集离心上清液。蛋白浓度用BCA法来测定。取50μg总蛋白样品,与上样缓冲液混匀后100℃煮5min后行垂直电泳,电泳结束后行湿转法转膜,转膜后用5.0%脱脂奶粉室温封闭1h,TBST洗膜三次,每次5min。一抗4℃孵育过夜,TBST洗膜三次,每次10min,二抗室温孵育2h。用（Odyssey 2.0）软件进行扫描及分析。结果重复3次。4.CCK8法测量细胞活性在96孔中接种100μl的细胞悬液,将培养板在培养箱中预培养24小时（37℃,5%CO2）后,每孔中加入10μl FAK inhibitor 14（10μmol/L）及CCK-8溶液,到时间后用酶标仪测定450nm的吸光度。结果1.巨噬细胞模型建立成功:THP-1（人单核细胞株）细胞在5ng/ml的PMA诱导下,用显微镜观察可看见圆形悬浮的THP-1细胞逐渐聚焦成团,伸出伪足、贴壁,分化成为巨噬细胞。刺激分化48小时后经细胞计数比较,诱导率大于95%。2.CD147刺激巨噬细胞后以时间依赖性的方式增加FAK及MMP9转录水平的表达。将细胞分为CD147刺激0h组、CD147刺激3h组、CD147刺激6h组、CD147刺激9h组、CD147刺激12h组,用1ng/ml CD147刺激巨噬细胞,FAK 9h时到达最高（3.908±0.106 vs.1 P<0.05）。3.CD147刺激巨噬细胞后以时间依赖性的方式增加FAK及MMP9蛋白水平的表达。将细胞分为CD147刺激0h组、CD147刺激3h组、CD147刺激6h组、CD147刺激9h组、CD147刺激12h组,用1ng/ml CD147刺激巨噬细胞后,蛋白表达量均有所上升,其中FAK（1.930±0.024 vs.1 P<0.05）与pFAK（1.737±0.021 vs.1 P<0.05）的相对蛋白表达量于9小时达到高峰,而MMP9的蛋白表达量于6h到达峰值（1.527±0.033 vs.1,P<0.05）。4.CD147刺激巨噬细胞后以剂量依赖性的方式增加FAK及MMP9转录水平的表达。分别用0,0.1,0.5,1,5,10ng/ml的CD147刺激巨噬细胞9小时后,发现,在0.1-1ng/ml之间存在剂量依赖关系,而在1-10ng/ml时无统计学差异。5.CD147刺激巨噬细胞后以剂量依赖性的方式增加FAK及MMP9蛋白水平的表达。分别用0,0.1,0.5,1,5,10ng/ml的CD147刺激巨噬细胞9小时后,发现,在0.1-1ng/ml之间存在剂量依赖关系,而在1-10ng/ml时无统计学差异。6.用FAK inhibitor 14抑制FAK Y397位点磷酸化后,CD147刺激巨噬细胞9h时的MMP9的蛋白表达与对照组相比明显下降。与对照组相比,加入FAK inhibitor 149h后显著地降低了FAK（0.220±0.024 vs.1,P<0.05）、pFAK（0.077±0.012 vs.1,P<0.05）及MMP9（0.133±0.012）的蛋白表达水平.结论:pFAK是CD147刺激单核-巨噬细胞后生成MMP-9的重要通路,也可能在参与了ACS的发生和发展。