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目的1.检测痴呆患者血清miR-137、miR-155和miR-223的表达,初步筛选与痴呆显著相关的microRNAs。分析靶标miRNAs在痴呆患者血清外泌体中的水平,探讨外泌体miRNAs的表达水平与白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、C反应蛋白(CRP)水平、简易智力状态检查量表(MMSE)及核磁波谱mI/Cr、NAA/Cr之间的关系,构建外泌体miRNAs的ROC曲线,探讨外泌体miRNAs在痴呆患者临床辅助诊断价值。2.构建阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)细胞模型,并建立AD细胞模型与间充质干细胞(MSCs)或MSCs来源的外泌体的共培养体系,分析MSCs及其来源的外泌体对AD细胞模型的修复作用与机制,为AD的诊疗提供新的思路。方法1.本研究共纳入48例受试者,32例痴呆患者,包括11例AD初诊患者、11例已接受单一美金刚治疗的AD患者及10例血管性痴呆(vascular dementia,VaD)患者,同时收集16例相匹配的健康人群作对照。试剂盒沉淀法提取血清外泌体,纳米颗粒追踪分析仪、免疫印迹法及免疫荧光法鉴定外泌体;RT-PCR法检测血清miR-137、miR-155及miR-223的表达水平,并检测外泌体miR-223的表达水平;ELISA法检测血清IL-1β、IL-6、TNF-α和CRP浓度,并评定MMSE量表评分、收集患者海马区核磁波谱。分析外泌体miR-223与炎症因子、MMSE量表评分和核磁波谱的相关性,并构建外泌体miR-223的ROC曲线。2.构建并鉴定AD细胞模型,提取并鉴定MSCs及其分泌的外泌体。AD细胞模型与MSCs及其分泌的外泌体进行共培养后,分析AD细胞模型的形态、凋亡率、神经元迁移能力及炎症反应水平。通过抑制或过表达miR-223,进一步分析MSC来源的外泌体miR-223通过调控PTEN干预PI3K/Akt通路来修复受损神经元。结果1.纳米粒子跟踪分析(NTA)检测所提取的外泌体粒径在100nm左右,蛋白质免疫印迹(WB)显示外泌体特征性表面标记蛋白CD63和CD81在痴呆患者组及健康对照组皆有表达。免疫荧光显示出被标记的外泌体聚集在细胞内。2.痴呆组血清miR-137、miR-155及miR-223水平均低于健康对照组(P=0.262、0.113及0.049),仅miR-223的差异具有统计学意义。AD组miR-223水平低于VaD组,AD初诊组miR-223水平低于AD经治组,差异均具有统计学意义。痴呆组外泌体miR-223水平较健康对照组明显降低,AD组外泌体miR-223水平较VaD组明显降低,AD初诊组外泌体miR-223水平较AD经治组明显降低,差异均具有统计学意义。3.相关性分析结果显示,外泌体miR-223与MMSE评分呈正相关,与海马波谱mI/Cr呈正相关,与海马波谱NNA/Cr呈负相关。相关性分析结果显示,血清4种炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α及CRP在健康对照组与痴呆组、AD组与VaD组、AD初诊组与AD经治组表达水平均有统计学差异。外泌体miR-223水平与血清炎性因子浓度皆成负相关。4.ROC曲线下面积分析结果显示:外泌体miR-223对痴呆的ROC曲线下面积为0.875(95%CI:0.7779-0.9721,P<0.01)。5.建立AD细胞模型,进行形态学及功能学鉴定,结果显示AD细胞模型表现出细胞形态显著改变,细胞凋亡水平上升,细胞迁移能力减弱,Aβ的蛋白水平提高。6.提取MSCs及其外泌体进行鉴定。MSCs细胞形态为典型成纤维状,细胞表面标记物CD29、CD44、CD90呈阳性表达,CD11b、CD45呈阴性表达,具有成骨分化能力;NTA显示外泌体粒径峰值在100nm,电镜显示外泌体呈双凹蝶形,表面标记蛋白CD63和CD81呈阳性表达,而Tubulin表达阴性。7.MSCs或其来源的外泌体与AD细胞模型共培养后,AD细胞模型内凋亡率显著下降,神经元迁移能力提高,细胞上清内炎症因子水平下降,用GW4869抑制MSCs外泌体分泌后,细胞损伤复现。标记外泌体的MSCs与AD细胞模型共培养,共聚焦显微镜结果表明AD细胞模型摄取MSCs来源的外泌体,细胞内外泌体总量显著提高。AD细胞模型内化外泌体并修复自身受损细胞,细胞凋亡水平下降,神经元迁移能力提高。8.AD细胞模型与MSCs或MSC来源的外泌体共培养后,AD细胞模型内miR-223表达升高,PTEN蛋白水平下降。过表达MSCs内miR-223后,AD细胞模型内PTEN蛋白水平下降,而p-Akt水平上升,同时细胞迁移能力提高、细胞凋亡水平下降和炎症反应减轻,反之亦然。结论1.痴呆患者血清miR-137、miR-155和miR-223表达水平,仅miR-223的差异具有统计学意义。2.痴呆患者外泌体miR-223水平较健康对照组显著降低,且与4种炎性因子、临床量表及核磁波谱具有显性相关性,外泌体miR-223的ROC曲线证实其可作为辅助诊断痴呆患者的血清学指标,在痴呆的发病机理中占据着重要作用。3.AD细胞模型可摄取并内化MSC来源的外泌体,从而修复受损神经元保护神经细胞。4.MSCs及其源性外泌体通过传输miR-223,下调PTEN蛋白水平,激活PI3K/Akt通路,抑制神经元凋亡,修复受损神经元。