昆虫种类繁多、生长环境多样,在生物链中扮演着重要角色。很多昆虫的幼虫生长于腐烂的有机质中,或者成为传播植物或动物病原的载体。昆虫在长期的进化过程中形成了一套有效的防御机制,即坚硬的体壁及其完善的免疫系统。昆虫的免疫系统主要由体液免疫和细胞免疫组成,体液免疫指在昆虫血淋巴中对病原物的识别,蛋白酶的级联反应,诱导产生的抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs),黑化反应(melanization)的中间产物,及其他存在于体液中的免疫因子等。昆虫的细胞免疫指由血细胞介导的吞噬(phagocytosis)、结瘤(nodulation)、包囊(encapsulation)等作用。抗菌肽是体液免疫中对入侵的病原菌具有直接杀伤力的效应因子,它在昆虫免疫中具有举足轻重的作用。黑化反应主要作用于伤口愈合、包囊黑化,以及在血淋巴中对病原微生物的直接杀灭,它是昆虫免疫中不可缺少的关键反应。而酚氧化酶(Phenoloxidase,PO)是黑化反应中的关键酶。产生抗菌肽的Toll途径和酚氧化酶前体(proPhenoloxidase,PPO)都需要在识别病原微生物后激活胞外丝氨酸蛋白酶(Serine Protease)级联反应从而被激活。在昆虫免疫中,Serpin(serine protease inhibitor)家族的蛋白参与负调控抗菌肽的产生以及酚氧化酶原的激活。家蚕(Bombyx mori)作为鳞翅目的模式昆虫,对其Serpin的研究起于早期日本学者的探索,但后期并未有深入的研究。直到完成家蚕全基因组测序,家蚕Serpin的研究又开始受到关注,但仍然处于起步阶段,家蚕多数Serpin的功能并未被深入探索。本研究主要对家蚕Serpin-5(BmSpn-5)蛋白进行了原核表达、纯化,详细深入地研究了BmSpn-5对家蚕免疫系统的调控,并初步探索了其机制。研究结果如下:(1)本试验在家蚕体内建立了包囊黑化的模型。为探明BmSpn-5是否对包囊黑化起作用,本试验首先在家蚕体内建立了QFF琼脂糖凝胶颗粒(Q-Sepharose Fast Flow)在家蚕血腔内发生包囊黑化的模型。QFF凝胶颗粒能够迅速地引起家蚕的包囊反应,1h时就能观察到大量血细胞包围在凝胶颗粒周围。8h时,血细胞已基本完成包囊作用,形成了外围和内层血细胞致密、中间血细胞松散的三个层次的包囊结构。并且包囊大多粘附在家蚕的组织上。部分QFF凝胶颗粒会发生包囊黑化作用,发生部位在凝胶颗粒表层而非其周围的血细胞。黑化作用主要发生在前8小时内,在这段时间内发生黑化的凝胶颗粒的比例迅速增长,其后便会进入平台期。(2)本研究对BmSpn-5进行了基因序列分析、原核表达和重组蛋白的纯化。基因序列同源性分析表明BmSpn-5与烟草天蛾(Manduca sexta)Serpin-5同源性最高,暗示二者具有相似的生物功能。Bm Spn-5蛋白质结构预测表明它是一个具有抑制活性的Serpin蛋白。我们利用pET32a质粒及BL21(DE3)菌株,成功地在细菌细胞质中表达出了BmSpn-5重组蛋白。随后经过镍亲和柱纯化,肠激酶酶切,再次经过镍柱及阴离子交换柱(Q柱)的纯化最终得到了纯度较高BmSpn-5重组蛋白。此外,我们利用纯化的重组蛋白制备了BmSpn-5的抗体,其效价较高。(3)本试验研究出BmSpn-5参与家蚕免疫应答,并且负调控家蚕抗菌肽的诱导产生。在家蚕体内,细菌的入侵能够引起脂肪体中BmSpn-5显著的上调表达,表明BmSpn-5参与免疫应答。将重组Bm Spn-5蛋白注射到家蚕幼虫体内,随后感染细菌从而引起家蚕免疫反应。24小时后,发现注射BmSpn-5重组蛋白的实验组其血浆抗菌活性较低;电泳图中在抗菌肽Gloverin和Cecropin的位置,对照组和实验组的条带差异明显;定量PCR检测到家蚕抗菌肽gloverin-3,cecropin-D,-E的表达受到Bm Spn-5蛋白的负调控。这些结果表明BmSpn-5对家蚕抗菌肽的产生具有负调控作用。(4)本试验检测到BmSpn-5抑制家蚕PPO的激活,从而抑制黑化反应。将重组BmSpn-5蛋白注射到家蚕幼虫体内,随后为其注射QFF凝胶颗粒,4小时之后候检测包囊黑化作用,发现注射Bm Spn-5重组蛋白的实验组其包囊发生黑化的比例明显低于对照组。给家蚕幼虫注射灭活的耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis serotype O:3,YPIII)会引起家蚕全局黑化反应,若提前为家蚕注射BmSpn-5重组蛋白则会避免全局黑化反应的发生。PO是黑化反应中的关键酶,实验表明BmSpn-5重组蛋白能够抑制由E.coli-PG,LPS及Curdlan引起的PO的活性,并且能够抑制PPO的剪切及PO与其它分子形成高分子复合物。这些结果表明BmSpn-5通过抑制家蚕PPO的剪切激活从而抑制黑化作用的发生。(5)最后,本试验分析鉴定了家蚕血淋巴中BmSpn-5的可能靶标蛋白酶。根据Serpin蛋白和其底物能够形成共价复合体的特点,利用免疫共沉淀的方法,我们获得了家蚕血淋巴中BmSpn-5与其底物蛋白酶形成的复合体。质谱分析表明复合体含有丝氨酸蛋白酶BmHP6和BmSP21。表明BmSpn-5可能通过直接抑制丝氨酸蛋白酶BmHP6和/或BmSP21来负调控家蚕抗菌肽和PPO的激活。综上,本研究阐明了Bm Spn-5在家蚕体内参与免疫应答,其对具体的免疫途径如抗菌肽的诱导表达途径和黑化反应的激活途径具有负调控的作用,该作用可能通过直接抑制家蚕血淋巴中BmHP6和/或BmSP21的活性而完成。