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研究背景帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种以中脑黑质多巴胺（Dopamine,DA）神经元变性丢失为主要病理特征的神经退行性疾病。该病的典型临床表现包括静止性震颤、肌僵直、运动迟缓等运动功能障碍以及认知功能、精神行为异常等非运动功能障碍症状。目前PD的病因病机尚未明确,可能受到遗传、环境等多方面因素的影响,其发病机制与线粒体的形态和功能改变密切相关。PD的临床治疗尚无根治之法,西医的对症治疗存在一定的副作用,中药具有多成分多靶点的特点,在治疗PD中也发挥重要的作用。课题组前期研究中发现大补阴丸（Da-Bu-Yin-Wan,DBYW）对PD模型小鼠行为学有明显改善作用,对黑质DA能神经元数量、线粒体形态、线粒体酶复合物活性等均有保护作用。知母是DBYW的组成之一,其活性成分具有保护黑质DA神经元的作用,故以知母的有效成分知母皂苷B-Ⅱ（Timosaponin B-Ⅱ,TB-Ⅱ）作为单一干预措施,进一步探索DBYW中的有效成分保护线粒体形态和功能以防治PD的环节和靶点,为抗PD药物的筛选提供依据。研究目的从线粒体角度揭示临床防治PD的有效复方大补阴丸中知母的有效成分TB-Ⅱ对PD细胞的保护作用,为中药有效成分的进一步开发利用奠定基础。研究方法实验一 TB-Ⅱ最佳浓度及作用时间筛选:细胞分5组:①空白对照组:正常培养SH-SY5Y 细胞,不做其他处理;②TB-Ⅱ 0.1 组:SH-SY5Y 细胞+0.1μmol/L TB-Ⅱ;③TB-Ⅱ1.0 组:SH-SY5Y 细胞+1.0μmol/LTB-Ⅱ;④TB-Ⅱ 10 组:SH-SY5Y 细胞+10μmol/L TB-Ⅱ;（⑤）TB-Ⅱ 100组:SH-SY5Y细胞+10μmol/L TB-Ⅱ。各组TB-Ⅱ又分别作用24h、48h。CCK-8法检测各组细胞的存活率;Annexin V-PE标记,流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。实验二 TB-Ⅱ对PD细胞模型最佳治疗浓度筛选:细胞共分7组:①空白对照组:正常培养SH-SY5Y细胞,不做其他处理;②模型组:SH-SY5Y细胞+MPP+;③TB-Ⅱ 0.3治疗组:SH-SY5Y细胞+MPP++0.3μmol/L TB-Ⅱ;④TB-Ⅱ 1.0治疗组:SH-SY5Y细胞+MPP++1.0μmol/L TB-Ⅱ;⑤TB-Ⅱ 3.0 治疗组:SH-SY5Y 细胞+MPP++3.0μmol/LTB-Ⅱ;⑥TB-Ⅱ 10 治疗组:SH-SY5Y细胞+MPP++10μmol/L TB-Ⅱ;⑦TB-Ⅱ 30 治疗组:SH-SY5Y细胞+MPP++30μmol/L TB-Ⅱ。TB-Ⅱ作用24h后,在倒置荧光显微镜下观察细胞形态,CCK-8法检测各组细胞的存活率。实验三 TB-Ⅱ对PD细胞模型线粒体形态和功能的影响:细胞共分5组:①空白对照组:正常培养SH-SY5Y细胞,不做其他处理;②模型组:SH-SY5Y细胞+MPP+;③TB-Ⅱ 低浓度组:SH-SY5Y 细胞+MPP++0.3μmol/L TB-Ⅱ;④TB-Ⅱ 中浓度组:SH-SY5Y细胞+MPP++1μmol/LTB-Ⅱ;⑤TB-Ⅱ 高浓度组:SH-SY5Y 细胞+MPP++3μmol/LTB-Ⅱ。CCK-8法检测各组细胞的存活率;Annexin V-PE标记,流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率;JC-1染料标记线粒体,激光扫描共聚焦显微镜观察,检测线粒体膜电位;荧光素酶法检测细胞中相对ATP水平及ADP/ATP比值;MitoSOXTM Red标记,流式细胞仪检测细胞ROS水平;MTR（MitoTracker?Red CMXRos,MTR）线粒体探针标记线粒体,激光扫描共聚焦显微镜观察线粒体的形态,利用软件分析线粒体的活性、形态因子、网络平均分支长度和数量。研究结果实验一结果:细胞存活率和细胞凋亡率均显示:当作用时间为24h时,0.1、1、10μmol/L浓度的TB-Ⅱ组均与空白对照组无明显差异,100μmol/LTB-Ⅱ组的细胞存活率几乎为0,凋亡率显著上升;当作用时间为48h时,各TB-Ⅱ组细胞存活率均明显下降,且100μmol/L TB-Ⅱ组细胞凋亡率显著上升。故后续实验选取TB-Ⅱ作用于细胞的时间为24h,最佳浓度区间为 0.1～10μmol/L。实验二结果:细胞形态和存活率结果显示:与空白对照组比较,模型组细胞明显萎缩,体积减小,呈现梭形或圆形,细胞密度减小,存活率显著降低,;与模型组比较,TB-Ⅱ 0.3、1、3治疗组细胞胞体较饱满,细胞密度增大,存活率显著上升,而TB-Ⅱ 10、30治疗组细胞形态与模型组比较无明显区别,且TB-Ⅱ 10治疗组细胞存活率明显下降。故选择0.3、1、3μmol/L作为TB-Ⅱ对PD细胞的最佳治疗浓度进行后续实验。实验三结果:1.细胞存活率和凋亡率的变化:与空白对照组比较,造模之后各组细胞存活率均显著降低,凋亡率均显著升高;与模型组比较,TB-Ⅱ低、中、高浓度组的细胞存活率均显著上升,凋亡率均明显降低。2.线粒体功能的变化:与空白对照组比较,MPP+处理后各组细胞线粒体膜电位、相对ATP水平均显著降低,ADP/ATP比值和ROS水平均显著升高;与模型组相比,TB-Ⅱ低、中、高浓度组线粒体膜电位和相对ATP水平均明显增加,ADP/ATP 比值和ROS水平均显著降低;其中TB-Ⅱ中浓度组线粒体膜电位和相对ATP水平最高,TB-Ⅱ低浓度组ROS水平最低。3.线粒体活性和形态的变化:与空白对照组比较,MPP+处理后各组细胞线粒体的活性、形态因子、网络平均分支长度、网络平均分支数均明显下降;低、中、高浓度的TB-Ⅱ治疗后以上指标均显著增加;其中TB-Ⅱ高浓度组线粒体活性较TB-Ⅱ低、中浓度组明显增加。结论1.TB-Ⅱ在0.1～10μmol/L的浓度范围内,作用24h,对SH-SY5Y细胞没有毒性。2.0.3、1、3μmol/L浓度的TB-Ⅱ对PD细胞模型具有一定的治疗作用。3.TB-Ⅱ可改善MPP+对SH-SY5Y细胞线粒体功能的损伤,拮抗膜电位的降低、增加ATP的生成、降低ROS的产生,修复线粒体网络形态,从而减少细胞凋亡,达到治疗PD的作用。