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后基因组时代，基于全基因组序列的研究越来越多，这就要求研究者们能够在短时间内以最高的效率获得某一样品的全基因组序列。就技术而言，目前全基因组序列的体外获得主要是通过DNA体外拼接的方式完成，但大多数体外拼接方法都存在拼接长度有限、拼接效率低、步骤繁琐和成本高等缺点，本课题中采用的重叠延伸PCR和Gibson等温一步拼接法就是两种典型的DNA体外拼接技术，然而重叠延伸PCR拼接技术的应用受限于其拼接长度，而Gibson等温一步拼接法拼接片段长度虽然可以达到几百kb，但是其成本却很高，且拼接效率很低。近年来的一些研究成果表明纳米材料和核内小分子可以通过与DNA片段或DNA聚合酶相互作用，或者降低目的产物的Tm值等机制对DNA片段的PCR扩增起到增效作用，受这些研究的启发，本课题将这些新型的PCR添加剂应用于重叠延伸PCR拼接法和Gibson等温一步拼接法中，从而对两种拼接方法的拼接长度和拼接效率进行了改善。本课题主要进行了四个方面的研究工作：含有重叠序列的短DNA片段的获得；小分子对重叠延伸PCR拼接效率影响效率的研究及增效小分子的筛选；小分子对GibsonAssembly拼接效率影响的研究及增效小分子的筛选；增效小分子增效机制的研究。含有重叠序列的短DNA片段的获得主要是通过设计接头引物，并借助PCR扩增的方法进行。本课题共设计了15对接头引物，利用这些接头引物扩增获得的短DNA片段之间可人为添加上一段overlaps，overlaps有40bp、80bp和202bp三种长度。这些短DNA片段进行拼接可获得长达6kb、10kb和27kb的长及超长DNA片段。小分子对重叠延伸PCR和Gibson Assembly拼接效率影响的研究及增效小分子的筛选，则首先通过测试小分子的使用浓度、反应条件、检测方法等实验参数建立了两种实验模型，然后将小分子添加在拼接体系中，通过观察各组的拼接效率判断各种小分子对两种拼接方法拼接效率的影响，从而筛选出了具有增效作用的小分子。最终筛选出了一种对GibsonAssembly具有增效作用的核内小分子，是23号肌苷；三种对重叠延伸PCR具有增效作用的核内小分子，分别为23号肌苷、29号异亮氨酸和32号缬氨酸；得到四种对重叠延伸PCR有增效作用的纳米材料，分别为18号羧基化短双壁碳纳米管、39号短多壁纳米碳管、48号羟基化的短多壁纳米碳管和53号羧基化短多壁碳纳米管。对于小分子增效机制的研究主要通过Q-PCR的方法进行测试。经初步研究发现小分子可以显著提高DNA扩增的特异性，并将基因片段的Tm值降低。本课题筛选出了对DNA体外拼接方法有增效作用的小分子，为增效剂在DNA体外拼接技术中的应用打下了基础。