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MicroRNA (miRNA)是一类长度在20～24个核苷酸的非编码RNA,主要在转录后水平或者翻译水平特异性调控靶基因的表达。在模式植物拟南芥中已经发现了200多个miRNA,其中与开花相关的有三个,分别为miR156, miR172和miR159,这些miRNA对植物的成花转变起到重要的调控作用。目前,针对非模式植物,特别是花卉植物中miRNA调控花发育的研究很少。本文以观赏性花卉大岩桐为材料,研究miR159和miR172对成花途径中关键靶基因的调控作用及其机理分析,探索通过操纵miRNA表达改变花卉植物花发育和花期的基因工程分子育种新策略。获得主要试验结果如下：1miR159表达对大岩桐花发育的影响GAMYB基因全序列的克隆及miR159剪切位点的验证根据GAMYB家族的序列保守性,利用5’RACE和3’RACE的方法克隆得到了大岩桐GAMYB cDNA全序列。利用RLM5’RACE方法,鉴定出SsGAMYB基因的964-985bp区域的第11位碱基是miR159的直接剪切位点,证实该基因是miR159的靶基因。在野生型大岩桐中,miR159在幼苗时期的叶片以及萼片中高表达,在雄蕊中的表达量最低；而GAMYB在雄蕊中的表达最高,而在萼片中的表达量最低。GAMYB与miR159的不同表达模式说明miR159负调控大岩桐GAMYB的表达。利用农杆菌介导法获得miR159转基因大岩桐株系本研究采用拟南芥miR159a前体的茎环序列构建组成型过表达载体35S:miR159a,同时构建抑制miR159作用的MIM159表达载体35S:MIM159.运用农杆菌介导的转基因方法,获得32株miR159a过表达株系,28株35S:MIM159转基因株系,并用RT-PCR进行了转录水平的鉴定。miR159转基因株系的表型观察及其表达检测在短日照条件下,大岩桐35S:miR159a过表达株系花期延迟37(±4.93)天,而35S:MIM159转基因株系花期提前20(±3.5)天。定量RT-PCR检测发现35S:miR159a过表达株系中miR159成熟体序列大量积累,GAMYB基因的mRNA水平降低；而在35S:MIM159株系中,miR159a的积累明显下降,GAMYB基因的mRNA水平上升。说明改变miR159的表达水平可以调控靶基因GAMYB的表达,从而提前或延迟大岩桐的开花时间。利用qRT-PCR的方法检测转基因株系中GAMYB下游基因的表达变化qRT-PCR结果显示,在35S:miR159a过表达株系的花原基中LFY基因的表达量显著下降,而在35S:MIM159株系中LFY基因的表达量显著上调.MADS-box基因(SsAG, SsAP,和SsAP3)表达水平在miR159过表达植株中上升,而在miR159抑制植株中下降。表明miR159介导的GAMYB表达调控了成花关键基因LFY的表达水平,并进一步调控下游MADS-box基因的表达。说明35S:miR159a和35S:MIM159转基因株系花期的变化很大程度上与LFY基因表达水平相关。LFY基因异常表达引起大岩桐花器官形态的变化35S:miR159a过表达株系的花形态与野生型相似,而35S:MIM159转基因株系中,高表达LFY基因的株系出现了萼片和花瓣的相互转化,即萼片花瓣化以及花瓣萼片化。qRT-PCR试验结果表明在花瓣化的萼片中SsAPs表达量明显上升；而萼片化的花瓣中SsAP,表达量显著上升,SsAP3表达量明显下降。表明萼片和花瓣的相互转化可能与第一轮和第二轮花器官中SsAP,和SsAP,异常表达相关。2miR172表达对大岩桐花发育的影响大岩桐AP2基因部分cDNA片段的克隆根据GenBank上已登录的拟南芥、番茄和葡萄的AP2类基因的同源序列设计兼并引物,利用野生型大岩桐花蕾的cDNA做模版,克隆得到SsAP2的部分片段。经核酸序列比对发现SsAP2与拟南芥,番茄以及葡萄的AP2基因具有高度同源性。miR172转基因大岩桐的获得利用农杆菌介导法成功转化大岩桐的叶片,经过4轮潮霉素抗性筛选以及基因组DNA-PCR鉴定,成功获得了35S:miR172a过表达株系24株以及抑制miR172作用的35S:MI MIM72株系21株。miR172转基因大岩桐的表型观察在长日照条件下,35S:miR172a过表达株系花期比野生型提前47(±2.16)天；35S:MIM172株系花期延迟7(士4.28)天,而且35S:MIM172株系,植株相对矮小。在35S:miR172a过表达株系中miR172的表达水平明显上升,其靶基因SsAP2的表达量明显下降；35S:MIM172株系中raiR172的积累水平受到抑制,而SsAP2的表达量明显上升,表明miR172介导调控SsAP2的表达对大岩桐成花转变具有促进作用。miR172转基因大岩桐的形态学变化在大岩桐35S:miR172a过表达株系中出现萼片花瓣化；而在35S:MIM172株系中出现花瓣比野生型卷曲。这些花器官异常的株系中,AP2的表达量均发生明显变化,表明在大岩桐中SsAP2类基因的表达异常影响花器官的正常发育。综上所述,本研究结果表明在短日照条件下,通过转基因改变miR159的表达可以有效的调控靶基因GAMYB以及下游成花关键基因LFY的表达水平,进而显著提前或延迟了大岩桐的开花时间；而在长日照条件下,通过改变miR172的表达可以调控其靶基因AP2mRNA水平,也能明显提前或延迟大岩桐的花期。说明调控开花相关miRNA的表达水平可以改变大岩桐的花发育进程。基于植物miRNA序列的高度保守性,通过转基因的方法调控开花相关miRNA表达将为观赏性花卉的花发育和花期控制提供一条分子遗传育种的新途径。