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研究背景目前临床上用于心脏替代治疗的是机械人工心脏瓣膜或者戊二醛固定的来自于野生型猪或者牛组织的心脏瓣膜,简称GBHV。虽然成功应用于临床,但是存在一些问题导致移植效果不显著。戊二醛固定过的心脏瓣膜血管内皮细胞会失去活性,破坏移植效果。GBHV会经历钙化,导致结构性瓣膜退化,不得不再次手术,从而使发病率和死亡率上升。有研究发现不同年龄移植效果有显著差异,可能的原因是年轻人损耗快,免疫系统更强大,排斥反应更明显。而引起钙化和结构性瓣膜退化的主要因素就是抗体介导的免疫排斥反应。猪器官和组织中大量表达的α-1,3-半乳糖基转移酶(GGTA1),CMP-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β-1,4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(β4Gal NT2)是三种引起异种移植免疫排斥的主要抗原。研究目的猪器官和组织中表达的α-1,3-半乳糖基转移酶(GGTA1),CMP-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β-1,4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(β4Gal NT2)是三种引起异种移植免疫排斥的主要抗原。本实验拟通过CRISPR/Cas9技术敲除长白猪的GGTA1、CMAH和β4Gal NT2基因,获得免疫原性极大降低的猪心脏瓣膜,为心脏瓣膜临床替代治疗提供优化的材料来源。研究方法1.利用在线工具(http://crispr.mit.edu/)设计合成靶向GGTA1,CMAH和β4Gal NT2基因的single guide RNA(sg RNA),以p X330为骨架质粒,构建CRISPR/Cas9打靶载体并转染猪胎儿成纤维细胞。通过G418筛选获得单细胞克隆,测序鉴定获得GGTA1/CMAH/β4Gal NT2三基因敲除的猪胎儿成纤维细胞。2.通过体细胞核移植(SCNT)制备GGTA1/CMAH/β4Gal NT2敲除的长白猪。小猪打耳标记后,提取基因组,PCR产物连接T载体测序,得到克隆猪基因型。利用流式细胞术检测GGTA1/CMAH/β4Gal NT2三基因敲除猪的外周血单个核细胞(PBMC)中GGTA1,CMAH和β4Gal NT2抗原的表达情况;免疫组化和免疫荧光相结合检测心包膜组织中GGTA1,CMAH和β4Gal NT2抗原的表达情况。3.通过与人血清孵育实验,检测GGTA1/CMAH/β4Gal NT2三基因敲除猪PBMC以及心包膜组织中与人血清Ig G、Ig M的结合情况。对野生型和GGTA1/CMAH/β4Gal NT2敲除猪的心包膜进行胶原定量检测和单轴力学分析。实验结果筛选得到27个雄性细胞克隆,38个雌性细胞克隆,对细胞克隆进行测序鉴定后分别获得1个GGTA1/CMAH/β4Gal NT2敲除的雄性单细胞克隆和2个GGTA1/CMAH/β4Gal NT2敲除的雌性单细胞克隆。经体细胞核移植,获得8头GGTA1/CMAH/β4Gal NT2敲除长白公猪,基因型鉴定确认8头仔猪均为GGTA1/CMAH/β4Gal NT2敲除猪。流式细胞检测结果显示仔猪的PBMC中无GGTA1/CMAH/β4Gal NT2抗原的表达,免疫组化与免疫荧光显示心包膜组织中无GGTA1/CMAH/β4Gal NT2抗原的表达。人血清孵育实验结果显小猪的PBMC和人血清Ig M和Ig G几乎没有结合。免疫组化结果一致。胶原检测显示野生型和克隆猪的心包膜中都富含大量胶原纤维,基因敲除不会影响心包膜的胶原含量。单轴力学测试结果证明GGTA1/CMAH/β4Gal NT2猪的心包膜与野生型猪的心包膜力学性质无显著差异。结论本实验成功利用CRISPR/Cas9技术获得了GGTA1/CMAH/β4Gal NT2三基因敲除的长白仔猪,证明CRISPR/Cas9系统是猪基因敲除的高效工具。GGTA1/CMAH/β4Gal NT2三基因敲除猪的心包膜免疫原性极大降低,且其力学性质和野生长白猪无差异,可以作为制备临床用心脏瓣膜新的材料来源。