异养硝化细菌Pseudomonas putida strain LX1对重金属离子的耐受性及其作用机制研究

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通常大量含氮工业废水中同时会存在一定量的重金属,造成重金属和氮素的复合污染,损害水环境的生态平衡,对公众健康和生物多样性构成重大威胁。异养硝化-好氧反硝化作为一种高效的新型含氮污水处理技术,不仅能够在去除水中有机碳化合物的同时实现同步硝化反硝化脱氮,而且部分异养硝化细菌还对重金属具有耐受能力。本文在实验室长期受高浓度纳米氧化镍胁迫的活性污泥中,筛选出一株对重金属具有较强耐受能力的异养硝化细菌,并以K2Cr O4、Cr2O3、Ni O和Pb Cl2为试验材料,系统研究其对试验菌株的生长代谢过程以及相互作用机理,明确菌株耐重金属的分子机制,为异养硝化细菌的实际应用提供科学指导。研究结果如下:(1)从实验室长期受重金属胁迫的活性污泥中,筛选出对重金属具有耐受性的异养硝化菌LX1,显示其亦具有好氧反硝化性能,16S r DNA部分基因序列测序鉴定菌株LX1为恶臭假单胞菌。菌株LX1的菌落呈绿色、圆形、突出、表面光滑。菌株LX1的最佳生长和脱氮条件为丁二酸钠为碳源、C/N=10、r=160 r/min、p H=7、T=30°C。菌株LX1分别以NH4+-N和NO3--N作为唯一氮源时能够正常生长及脱氮,48 h内NH4+-N和NO3--N的最大去除率可达93.55%和81.68%。(2)不同浓度Cr2O3、K2CrO4、NiO和PbCl2胁迫对菌株LX1生长及脱氮特性的影响具有较大差异。K2Cr O4对菌株LX1的异养硝化作用影响较大,NH4+-N去除率随投加K2Cr O4浓度增加逐渐降低,浓度为5、10、25 mg/L时最大NH4+-N去除率为93%、90.3%和83.3%,但大于50 mg/L时菌株几乎停止生长。此外,Cr2O3、Ni O、Pb Cl2虽有一定的抑制作用,但菌株LX1恢复氨氧化的能力较好,在100 mg/L胁迫条件下最大NH4+-N去除率仍分别高达90.3%、89.25%、90.86%,表现出良好的耐受性。异养硝化过程表明加入K2Cr O4、Ni O和Pb Cl2后,过程中几乎无硝氮、亚硝氮等中间产物累积,可能是菌株LX1能够将产生的硝酸盐和亚硝酸盐作为反硝化底物直接利用。以NO3--N作为唯一氮源时,好氧反硝化结果显示整个培养过程中没有亚硝酸盐积累,可能是因为过程中产生的亚硝酸盐被亚硝酸盐还原酶立刻去除。(3)K2CrO4、NiO和PbCl2虽然会通过抑制关键酶活性进而影响菌株的生长与硝化作用,但抗氧化作用在一定程度上维持了正常生长代谢,且菌株LX1对Ni O和Pb Cl2的耐受性优于K2Cr O4。EPS三维荧光分析图谱表明,菌株LX1在K2Cr O4胁迫下生长代谢功能受损,类蛋白物质减少,腐殖质含量增多;受Ni O胁迫时随浓度升高类蛋白物质含量明显增多;而低浓度Pb Cl2刺激下类蛋白物质含量明显增多,高浓度Pb Cl2下蛋白类物质减少,腐殖质含量增多。(4)FTIR图谱显示加入三种重金属的红外光谱的谱形与对照组一致,几乎未改变,证实菌株LX1内部的官能团基本也未有明显变动,均存在酰胺基、C-O-C、羟基和磷酸基,但对峰的强度却带来不同程度的变化。XRD图谱反映出在受到重金属K2Cr O4、Ni O、Pb Cl2胁迫后特征峰位置基本未受影响,尖锐程度依据金属类型不同有一定程度变化。表明重金属吸附在菌株LX1表面,但未产生新物质,物质种类和晶格常数并没有随着重金属的添加而有所变化。(5)对受重金属铬胁迫菌株与原始菌株的转录组分析显示,GO富集表明主要在磷脂酰胺结合、改性氨基酸结合、主动跨膜转运蛋白活性、对氧化应激的响应、细胞膜和细胞外膜差异最为显著,说明转运功能、氧化应激和细胞膜的组成在菌株LX1应对重金属胁迫的响应中起重要作用。KEGG分析表明主要在生物膜的形成、细菌分泌系统、蛋白质输出、苯乙烯降解、酪氨酸代谢等途径富集比较显著。这些差异可能会增强菌株细胞膜的通透性,影响菌株LX1对培养基中的各种元素的利用以及生长过程中相关的酶的活性,进而使细胞生长以及代谢过程发生了差异。作为与Cr代谢相关的差异表达基因,甘油磷脂代谢路径的上调与菌株LX1抵抗重金属铬胁迫有密切关系。ABC转运蛋白被认为在微生物抗应激能力中起着重要作用,可以转运无机盐离子、糖、氨基酸等。热休克蛋白(HSPs 20)的显著下调也表达出HSPs在生物体对应激反应中发挥重要作用等。菌株LX1通过调控这些差异基因的表达来应对重金属的胁迫机制。
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