目的:
　　基于磁珠液相免疫反应检测体系与微流控芯片分析系统有机融合,旨在解决传统手工检测中多步骤操作导致结果精度差和大型检测仪器高耗材、高成本、集成度低等问题.本研究以上转发光纳米晶(UCNPs)作为荧光生物示踪物、生物活化羧基磁珠作为液相均质反应载体、微流控芯片检测作为定量分析系统、通过荧光生物传感器流路自动化进行衔接,建立基于磁珠液相免疫反应的半自动化、高效、快速微流控荧光定量检测系统.并通过食源性致病菌(如肠出血大肠杆菌O157∶H7、甲型副伤寒、霍乱弧菌O1型、O139型)与临床项目CTnI的检测,对所建平台进行了比较系统的性能评价,从而为实现POCT全自动化检测,方便及提高基层医疗服务的技术水平奠定基础.
　　方法:
　　1.磁珠液相免疫反应检测体系的建立与优化:以上转发光纳米晶(UCNPs)作为荧光生物示踪物,以羧基磁珠作为液相分散的检测载体,并在磁珠及UCNPs颗粒表面共价偶联特异性抗体,利用双抗体夹心法捕获抗原.在此过程中,通过磁珠用量、抗体筛选、样本检测体积及靶标捕获时间等条件的优化,提升检测的敏感性与速度;
　　2.生物荧光标记物的选择与优化:通过对不同批次的上转发光纳米晶(UCNPs)的选择及用量优化,使其更有效的与免疫磁珠及抗原形成特异性结合,实现稳定、高效率、高光学度的免疫识别光学信号展示.
　　3.微流控芯片检测系统的建立与优化:通过自主研发适用于本检测体系的微流控芯片,将与磁珠液相免疫反应有机融合,把进样、分离、反应、检测等部分集成在几平方厘米的面积内,从而高效、快速地完成样品的检测分析.
　　4.流路系统集成及性能评价:通过将自主研发的荧光生物传感器与微流控芯片检测系统进行流路集成,使进样、磁分离、检测等步骤整合,并用于食源性致病菌中的肠出血大肠杆菌O157:H7检测,对其敏感性、稳定性等性能进行评价.
　　结果:
　　1.采用EDC/NHS标记法将抗体共价偶联到带有羧基的磁珠表面,并用双抗体夹心法检测肠出血大肠杆菌O157∶H7等食源性致病菌时,磁珠用量为25μL,菌液体积为100μL时捕获率最高.其中肠出血大肠杆菌O157:H7检测限为103CFU/mL,甲型副伤寒、霍乱弧菌O1型及O139型检测限均为104CFU/mL,适用性广且稳定性高.
　　2.采用恒温振荡法将抗体标记到UCNPs颗粒表面,选用C-UCNPs颗粒与抗体标记时效果最佳;在双抗体夹心法检测体系中,UCNPs颗粒用量为25μL时检测效果最好,发光率最高.
　　3.将磁珠液相免疫反应检测体系与微流控芯片有机结合,检测肠出血大肠杆菌O157∶H7与沙门氏菌乙型副伤寒的最低检测限分别为103CFU/mL、104CFU/mL,线性量程范围分别为103CFU/mL-108CFU/mL,104CFU/mL-108CFU/mL.
　　4.通过自主研发的荧光生物传感器与微流控芯片检测系统进行流路集成并应用于食源性致病菌检测,其可在20min内完成操作.通过检测肠出血大肠杆菌O157∶H7进行性能评价,其检测限为103CFU/mL,检测范围为103CFU/mL-108CFU/mL,变异系数小于15%,显示较好的线性及稳定性(r=0.9703,P<0.0001).
　　5.结论:
　　本研究所建立基于磁珠液相免疫反应的微流控荧光定量检测系统,可应用于食源性致病菌肠出血大肠杆菌O157∶H7及甲型副伤寒等定量检测,最低检测限可达103CFU/mL或更低.在此体系中,以上转发光纳米晶(UCNPs)作为荧光生物示踪物,由于整个实验过程中不涉及荧光的淬灭,因而稳定性较好、可重复多次检测并且保质期长,确保了该技术在检测过程中精密性、准确性.所建系统试剂耗材少,集成进样、磁分离、反应、检测过程,可在20min内完成全部操作过程,保证检测结果的稳定性.因此解决了传统POCT检测中因材料或试剂等耗材所带来的费时、稳定性差、成本高、集成度低等问题,为实现最新POCT自动化检测奠定了基础.