论文部分内容阅读
原发性支气管肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一,整合素受体αvβ3高表达于肿瘤新生血管内皮细胞和表面,精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)多肽能特异性识别整合素受体αvβ3。本研究合成了含两个二硫键的环状多肽CDCRGDCKC(cRGD),其结构为:c(Cys-Arg-Gly-Asp-dSer-Cys)-dSer-Lys(Gly-(D)-Ala-Gly-Gly-Aba)-Lys-dSer-c(Cys-Arg-Gly-Asp-dSer-Cys),用锝-99m(99Tcm)和铼-188(188Re)进行标记该小分子多肽后,进行靶向非小细胞肺癌的显像和治疗研究。一、99Tcm标记c(RGD)2在非小细胞肺癌裸鼠模型显像的实验研究1.99Tcm标记c(RGD)2环肽实验目的:研究标记率高且稳定的99Tcm标记c(RGD)2环肽的方法学。方法:采用预锡化直接标记法进行99Tcm标记c(RGD)2环肽实验,取10ml西林瓶,加入酒石酸缓冲液100μl,再加入20μl RGD原液,加入5μl氯化亚锡溶液,再加入1M氢氧化钠溶液调节pH至3-4,充满氮气于室温下反应过夜。过夜之后再加入5μl氯化亚锡溶液,再加入1M氢氧化钠溶液调节pH至3-4,加入100μl99mTcO4-溶液,后补加微量的1M氢氧化钠溶液调节pH至3-4,充满氮气于95 ℃反应45 min。结果:当标记条件为:标记反应时间为45min,SnC12·2H20质量浓度10g/L,20μl c(RGD)2(2g/L),洗脱液体积为 100μl 时,99Tcm-c(RGD)2 的标记率可达(96.02±3.47)%,99Tcm-c(RGD)2 在人新鲜血清中24h后其放射化学纯度仍大于90%。结论:用预锡化直接标记法进行99Tcm标记c(RGD)2环肽,标记率高且稳定性良好。2.99Tcm-c(RGD)2在正常小鼠体内生物分布实验目的:了解99Tcm-c(RGD)2在正常小鼠体内生物分布。方法:取正常ICR小鼠36只,随机分成6组,每组6只,每只小鼠尾静脉注射新鲜配制的0.1m199mTc-c(RGD)2(约370KBq)后,分别于注射后30min、1h、2h、4h、8h、24h各处死一组小鼠。解剖取脑、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、胰腺、肌肉、甲状腺、骨等组织和100μl颈动脉血液,称重后用γ计数仪测定放射性计数,计算每克脏器或组织的放射性计数占总注入剂量的百分比(%ID/g)。结果:正常小鼠注射99Tcm-c(RGD)2后肾脏组织的放射性摄取最高,提示标记物自肾脏代谢。结论:尾静脉注射99Tcm-c(RGD)2,该药物主要经肾脏排谢。3.99Tcm-c(RGD)2在荷瘤裸鼠体内生物分布实验目的:了解99Tcm-c(RGD)2在荷瘤裸鼠体内生物情况。方法:取荷非小细胞肺癌A549肿瘤BALB/c裸鼠36只,分别经尾静脉注入99Tcm-c(RGD)2注射液0.1ml(约370KBq),分别于30min,1,2,4,8,24h断头每组各处死6只裸鼠,收集血液,取出脑、心、肝、脾、肺、胃、胰、肠、肾、肌肉、甲状腺及肿瘤组织,称重并测定其放射性(cpm),结果换算为ID%/g。结果:注射99Tcm-c(RGD)2后肿瘤组织的放射性摄取1h时达到高峰,而后缓慢下降,此时肾脏、肝脏和脾脏等腹腔器官有较多放射性摄取,99Tcm-c(RGD)2在血液中清除速度快,4h时肿瘤与肌肉的放射性计数比值(T/NT)为3.09±0.27。结论:注射99Tcm-c(RGD)2后肿瘤组织的放射性摄取1h时达到高峰,而后缓慢下降,在血液中清除速度快,有成为非小细胞肺癌的靶向显像剂的可能。4.荷A549细胞肿瘤裸鼠的99Tcm-c(RGD)2 SPECT显像目的:研究荷A549细胞肿瘤裸鼠的99Tcm-c(RGD)2SPECT显像。方法:取5只荷瘤裸鼠,尾静脉注射0.1ml 3.70～5.55MBq 99Tcm-c(RGD)2,并分别于注射后30min,1,2,4,6h将裸鼠俯卧位固定于配有低能高分辨平行孔准直器的SPECT下进行平面显像。荷瘤鼠尾静脉注射99Tcm-c(RGD)2 1h后,即可见肿瘤部位有清晰放射性浓聚,随时间延长,2～6h肿瘤显影逐步降低,肝、脾、肾和膀胱有较高的放射性分布,其余器官如脑、肺、小肠及肌肉等无明显放射性浓聚。结果:尾静脉注射99Tcm-c(RGD)2肽后1h后肿瘤即可清晰显像,2～6h肿瘤显影逐步降低。结论:99Tcm-c(RGD)2肽有望成为非小细胞肺癌的靶向显像剂。二、188Re标记c(RGD)2在非小细胞肺癌裸鼠模型显像的实验研究1.188Re标记c(RGD)2环肽实验目的:研究188Re标记c(RGD)2环肽的方法学。方法:采用预锡化直接标记法进行188Re-c(RGD)2标记实验,取20μl的RGD,加入100μl酒石酸缓冲溶液,震荡使其溶解。再加入15μl(10g/L)SnC12,震荡溶解。再加入7μl NaOH调节pH至3-4,加入100μl188ReO4-新鲜洗脱液,油浴锅中加热95℃,反应30min。结果:当标记条件为:反应时间为30min,SnC12·2H20质量浓度10g/L,10μl c(RGD)2(2g/L),洗脱液体积为 100μl 时,188Re-c(RGD)2 的最佳标记条件下标记率为(95.39±3.07)%,188Re-c(RGD)2在人新鲜血清中24 h后其放射化学纯度仍大于90%。结论:用预锡化直接标记法进行188Re标记c(RGD)2环肽,标记率高且稳定性良好。2.188Re-c(RGD)2在正常小鼠体内生物分布实验目的:了解188Re-c(RGD)2在正常小鼠体内生物分布。方法:取正常ICR小鼠36只,随机分成6组,每组6只,每只小鼠尾静脉注射新鲜配制的0.1ml188Re-c(RGD)2(约370KBq)后,分别于注射后30min、1h、2h、4h、8h、24h各处死一组小鼠。解剖取脑、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、胰腺、肌肉、甲状腺、骨等组织和100μl颈动脉血液,称重后用γ计数仪测定放射性计数,计算每克脏器或组织的放射性计数占总注入剂量的百分比(%ID/g)。结果:正常小鼠注射188Re-c(RGD)2后肝、脾、肾脏组织的放射性摄取最高,在血液中下降速度快。结论.:尾静脉注射188Re-c(RGD)2,该药物主要经肝脏和肾脏代谢,在血液中清除速度快,代谢方式与99Tcm-c(RGD)2并不相同,有成为非小细胞肺癌的靶向显像剂的可能。3.188Re-c(RGD)2在荷瘤裸鼠体内生物分布和SPECT显像目的:研究荷A549细胞肿瘤裸鼠的188Re-c(RGD)2 SPECT在荷瘤裸鼠体内生物分布和SPECT显像情况。方法:取荷非小细胞肺癌A549肿瘤BALB/c裸鼠36只,清洁级BALB/c裸鼠及荷瘤裸鼠,分别经尾静脉注入188Re-c(RGD)2注射液0.1ml(370KBq),30min,1,2,4,8,和24h断头处死,收集血液,取出脑、心、肝、脾、肺、胃、胰、肠、肾、肌肉、甲状腺及肿瘤组织,称重并测定其放射性(cpm),结果换算为每克组织百分注射剂量(ID%/g),计算肿瘤(T)与其他组织(NT)的放射性比值(T/NT)。结果:注射188Re-c(RGD)2后肿瘤组织的放射性摄取2h时达到高峰,其每克组织百分注射剂量为3.64±0.71(%ID/g),而后缓慢下降,此时肝、脾和肾脏等腹腔器官有较多的放射性摄取,188Re-c(RGD)2在血液中清除速度快,24h时肿瘤与肌肉的放射性计数比值(T/NT)为3.07±0.71。结论:荷瘤鼠尾静脉注射188Re-c(RGD)2 1-4h后,可见肝、脾脏和膀胱有放射性明显浓聚,在肿瘤内每克组织百分注射剂量高,注射后24h时肿瘤与肌肉的放射性计数比值大于3,此与99Tcm-c(RGD)2无差异;但在SPECT显像中肿瘤未能清晰显影,有待进一步研究。4.MTT测定188Re-c(RGD)2细胞杀伤实验目的:通过MTT测定细胞生长抑制情况,验证188Re-c(RGD)2对A549细胞的杀伤作用。方法:在两块96孔板上接种细胞,起始细胞量为1×104/孔,培养24h至细胞贴壁后,弃去上清,实验组加入188Re-c(RGD)2 10μL(74kBq),对照组一加入10μμL等活度的188Re04-,对照组二加入10μL等量的c(RGD)2,对照组三加入10μL生理盐水,另设空白调零组。4h后,吸去上清液,PBS冲洗3次,每孔加100μL10%RPMI 1640继续培养,24及48h后分别取出一块96孔板,每孔加入20μL MTT(5mg/mL)试剂,另外加入80μL无血清RPMI1640培养基,37℃反应4h,吸掉上清液,加150μL DMSO(二甲基亚砜),37℃反应15min。在酶标分析仪上于492nm波长检测光密度(OD)值,按抑制率=(对照组OD值—实验组OD值)/对照组OD值,计算抑制率。结果:加入不同药物后24h,各组的OD值均出现下降,各组与生理盐水组相比,差异均有统计学意义(P<0.01);加入不同药物后48h,各组细胞OD值均增高,与24h组之间比较,差异有统计学意义(P<0.01)。188Re组和c(RGD)2组在24h与48h组之间差异无统计学意义(P>0.05);188Re-c(RGD)2组则随着时间延长,细胞的生长抑制率减低,两个时间点之间差异有统计学意义(P<0.05)。。48h时,188Re-c(RGD)2与188Re组和c(RGD)2组细胞生长抑制率之间差异有统计学意义(P<0.01);其他两组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:188Re和c(RGD)2单独作用可以抑制A549细胞的生长,188Re-c(RGD)2对A549细胞的生长抑制作用大于188Re和c(RGD)2单独作用。结论:1、预锡化直接标记法制备99Tcm-c(RGD)2简便快速,标记率达到95%以上,无需进一步纯化,且标记物放化纯保持稳定,24h后仍达到90%以上。2、尾静脉注射99Tcm-c(RGD)2,该药物主要经肾脏排谢。3、尾静脉注射99Tcm-c(RGD)2肽后1h后肿瘤即可清晰显像,有望成为非小细胞肺癌的靶向显像剂。4、预锡化直接标记法制备188Re-c(RGD)2标记率高,稳定性良好,在肿瘤内每克组织百分注射剂量高,24h时肿瘤与肌肉的放射性计数比值大于3,此与99Tcm-c(RGD)2无差异;但肝、脾摄取高,在SPECT显像中肿瘤未能清晰显影,有待进一步研究。5.188Re和c(RGD)2单独作用可以抑制A549细胞的生长,188Re-c(RGD)2对A549细胞的生长抑制作用大于188Re和c(RGD)2单独作用。