Fractalkine联合M2型巨噬细胞对胰腺癌细胞株干性影响的初步研究

来源 :宁夏医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:laverke
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目的:初步探讨趋化因子Fractalkine联合M2型巨噬细胞对胰腺癌细胞株(PANC-1)干细胞特性的影响。方法:1.构建合成Fractalkine(FKN)过表达的重组慢病毒HBLV-h-FKN-GFP-PURO,并对人胰腺癌细胞株PANC-1进行转染后筛选获得稳转株,应用RT-qPCR和Western blot法在基因和蛋白水平验证过表达FKN的PANC-1细胞是否成功建立;2.用佛波脂酸(phorbol myristate acetate,PMA)和人白介素4(interleukin-4,IL-4)序贯刺激诱导人白血病单核细胞THP-1成为M2型巨噬细胞,采用Western blot法检测Arg-1、iNOS蛋白表达;3.通过Transwell小室系统建立PANC-1细胞与M2型巨噬细胞非接触式共培养模型,检测FKN表达不同的PANC-1细胞对M2型巨噬细胞的趋化作用;4.共培养后收集小室下层的PANC-1细胞,Western blot法检测肿瘤细胞干性标记物CD44与CD133以及上皮间质转化相关分子E-cadherin和Vimentin的蛋白表达情况;5.再分别采用CCK-8法、划痕愈合实验以及Transwell小室法检测PANC-1细胞的增殖、迁移和侵袭能力;6.共培养后收集小室上层的巨噬细胞,Western blot法检测CX3CR1、Arg-1、CD163蛋白表达情况。实验结果分别应用单因素方差分析及2×2析因设计资料的双向分组方差分析进行统计分析。结果:1.慢病毒载体HBLV-h-FKN-GFP-PURO成功感染人胰腺癌细胞PANC-1后,过表达组FKN的mRNA和蛋白表达水平较空白对照组和空载体组均明显升高(P值均<0.001)。2.THP-1细胞经PMA与IL4序贯刺激诱导后成为Arg-1表达增高、iNOS表达降低的M2型巨噬细胞(PArg-1<0.001,PiNOS<0.01)。3.在体外趋化实验中,过表达FKN的PANC-1细胞趋化募集M2型巨噬细胞的能力明显增强(P<0.001)。4.检测PANC-1细胞,Western blot结果显示:FKN过表达后,PANC-1细胞的干性分子CD44及CD133表达增高,而上皮间质转化相关蛋白E-cadherin表达降低、Vimentin增高表达,且与M2型巨噬细胞共培养后,以上分子表达变化更显著;依据2×2析因设计统计分析,提示FKN与M2型巨噬细胞在影响CD44、CD133、E-cadherin表达时存在协同交互作用,对Vimentin的表达无交互作用(PCD44<0.05,PCD133<0.05,PE-cadherin<0.05,PVimentin>0.05)。5.FKN过表达或与M2型巨噬细胞共培养后,PANC-1细胞的增殖、迁移、侵袭能力均增加(P值均<0.001);当FKN过表达并且与M2型巨噬细胞共培养后,PANC-1细胞的增殖、迁移以及侵袭能力增加更明显,依据2×2析因设计资料的双向分组方差分析结果提示,FKN与M2型巨噬细胞之间存在交互协同作用(P增殖<0.01,P迁移<0.05,P侵袭<0.01)。6.检测巨噬细胞,Western blot结果显示:M2型巨噬细胞与PANC-1细胞共培养后CX3CR1、Arg-1、CD163蛋白表达均增高,且与高表达FKN的PANC-1细胞共培养后,以上分子蛋白表达更高(PCX3CR1<0.01,PArg-1<0.05,PCD163<0.01)。结论:1.趋化因子FKN在体外能促使人胰腺癌PANC-1细胞趋化募集M2型巨噬细胞。2.FKN和M2型巨噬细胞可协同增强PANC-1细胞的增殖、侵袭和迁移能力,并可增加PANC-1细胞上皮间质转化及癌细胞干性分子的表达,二者可协同维护胰腺癌干细胞特性。3.FKN可使其特异性受体CX3CR1在THP-1诱导获得的巨噬细胞表达增高,并促使巨噬细胞向M2方向极化。
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