氨肽酶N (Aminopeptidase N)是属于Ⅱ型锌离子依赖性金属蛋白酶M1家族的一类膜结合型外肽酶,以同源二聚体的形式广泛存在于哺乳动物的肾脏及小肠的刷状缘细胞、神经突触细胞等多种细胞的表面。作为一个外肽酶,APN具有广泛的生物学功能,可水解多种底物。更引人注意的是,相比正常细胞,APN在多种恶性肿瘤细胞表面高水平表达,在肿瘤组织的血管新生、侵袭、转移等过程中发挥着重要的作用,被称为肿瘤细胞表面相关抗原CD13。最近有研究表明,APN是肝癌肿瘤干细胞的表面标记物,与肿瘤的复发,转移和耐药性密切相关。因此,APN已成为抗肿瘤研究中的一个重要的靶标。目前已有的APN抑制剂可以分为天然和合成类APN抑制剂两大类。天然APN抑制剂主要有Bestatin、Probestin、Phebestin、AHPA-Val、Lapstatin、 Amastatin和Curcumin等；合成类抑制剂主要有：a-氨基醛类、a-氨基磷酸类、a-氨基硼酸类、β-氨基硫醇类、L-异谷氨酸类、L-赖氨酸类、L-硝基精氨酸类、环酰亚胺类、以及氨基萘满酮类等。虽然许多APN抑制剂被发现和合成出来,但是Bestatin仍然是目前唯一上市的APN抑制剂。制约APN抑制剂发展的主要问题是其低活性和其低选择性：现有的抑制剂对APN酶活的抑制能力都较弱,IC5o通常都在微摩尔水平；大部分的APN抑制剂存在选择性差的问题,不仅能抑制APN,对LAP、APB等其它的金属蛋白酶也有抑制作用。这就需要通过合理的药物设计寻找和开发高选择性的强效APN抑制剂。借助APN结构生物学的最新研究成果,由APN的活性位点结构及抑制剂与其的作用模式可知一个好的APN抑制剂应该包括四个部分：A)与S1口袋进行疏水性作用的芳环侧链；B)占据S1’口袋的氨基酸疏水性侧链；C)Zn离子螯合基团(Zinc Binding Group, ZBG); D)合适的连接基团将它们连接起来。本论文在前期工作的基础上,对先导物15的上述四个部分分别进行了一系列的结构优化和改造得到了四个系列的小分子类肽化合物,并对其进行了体外抑酶实验、体外抗肿瘤增殖实验以及体内抑瘤实验,以期从中筛选出具有较好抗癌活性的先导物。本论文共设计、合成了四个系列67个目标化合物,并对所有化合物通过核磁共振氢谱和电喷雾质谱等方法进行了结构确证。经文献查阅证实,所合成的化合物均为新型化合物,未见文献报道。体外酶抑制活性实验显示,在系列一中,用其它的ZBG来代替异羟肟酸引起化合物活性的大幅度降低,这说明一个合适的ZBG是化合物具有较强APN抑制活性的先决条件；系列二中,使用不同的连接基团如酰胺,磺酰胺等代替先导物中的脲基也引起活性出现一定程度的减弱。但是,我们发现在苯环的邻位引入取代基有利于化合物对APN的抑制活性；基于此结果我们设计了系列三化合物,酶活测试结果显示苯环邻位引入取代基使化合物的活性大幅度增加,其中化合物3b、3c的半数抑制浓度(IC50)达到了纳摩尔水平；而在系列四中,我们尝试在化合物的苯环上引入双取代,得到了IC5o低于阳性对照药Bestatin两个数量级的化合物4a。对人卵巢癌ES-2细胞表面的APN抑制实验结果与非人源APN酶抑制实验结果相似,说明我们的化合物对人源APN也具有很强的抑制活性。体外抗肿瘤增殖实验显示,目标化合物对肿瘤细胞的增殖有微弱的抑制能力,这种抑制能力与化合物对APN的抑酶活性无关,这与本实验的前期工作和一些文献报道相一致,说明了APN抑制剂不是依靠细胞毒性发挥抗血管新生和抗肿瘤作用。有文献报道APN抑制剂与5-Fu联用能增强5-Fu对肿瘤的杀伤能力。因此,在这里我们也考察了化合物4a与5-Fu联用对肿瘤细胞增殖的影响。实验结果表明目标化合物4a能增强5-Fu对肿瘤细胞增殖的抑制能力。体内抑瘤实验显示了相似的结果,单独使用4a能部分抑制小鼠中肿瘤的生长,而与5-Fu联用后能够增强其对肿瘤的抑制能力。这可能与其抑制了肿瘤干细胞和抗肿瘤新生血管生成能力有关。综上所述,本研究基于最新解析出的人APN的晶体结构及其抑制剂Bestatin与催化活性中心的结合模式,在前期工作基础上,设计、合成了四个系列的小分子类肽化合物。通过初步的活性筛选,我们发现了具有进一步研究价值的先导化合物3c、4a,并对其进行了以分子对接为主的构效关系研究,探讨了其APN活性位点的结合模式,为今后APN抑制剂的设计、合成奠定了基础。