二羟基丙酮(DHA)是最简单的酮糖,由于化学性质活泼,现在已经被广泛应用于医药、化工、化妆品行业。DHA的工业化生产主要以甘油为底物,通过氧化葡萄糖酸杆菌发酵生产。氧化葡萄糖酸杆菌是一种好氧型革兰氏阴性杆菌。生产DHA的过程中,主要有三种制约因素:底物抑制、产物抑制和溶氧。为了提高DHA的生产效率,本论文通过同源过量表达甘油运输蛋白促进菌体生长,提高甘油耐受性,同时过量表达甘油脱氢酶,构建利于DHA生产的氧化葡萄糖酸杆菌工程菌,主要内容如下:1.甘油运输蛋白在菌体内的过量表达及其对菌体生长的影响本文构建了含有四种不同启动子的甘油运输蛋白基因(glpF)的重组载体,导入到氧化葡萄糖酸杆菌,进行了同源过量表达分析。实验结果表明,glpF自身完整启动子、tuf B启动子、自身部分启动子、gmr启动子控制下的甘油运输蛋白的转录水平分别是原始菌的10倍、10倍、5倍和3倍,当在100 g/L甘油浓度时,其最终生物量OD600分别为4.8、4.7、4.2、3.5,而原始菌仅为2.5。随着甘油浓度的升高,原始菌生长受到严重抑制,250 g/L甘油时,原始菌基本停止生长,而4株工程菌则可以缓慢存活。从而得出,glpF的表达有效提高了菌体对甘油的耐受性。2.甘油脱氢酶在菌体内的过表达及其对细胞生长和DHA产量的影响本实验采用tufB启动子和甘油脱氢酶自身启动子控制甘油脱氢酶基因的过量同源表达分析。实验结果表明,tuf B启动子和自身启动子控制下的甘油脱氢酶的表达量基本相同,为原始菌的5倍左右,甘油脱氢酶的酶活也由原始菌的1.74U/mg分别升高到2.25 U/mg和2.14 U/mg。在过量表达甘油脱氢酶后,重组菌在种子培养基和100 g/L甘油培养基中的生长与原始菌基本相同。当在100 g/L甘油浓度下时,重组菌株DHA的产量比原始菌株提高了12.5%。3甘油运输蛋白和甘油脱氢酶在细胞内的双过表达及其对DHA生产的影响为了提高DHA的产量,我们在菌体内同时过表达甘油运输蛋白和甘油脱氢酶,实验表明,虽然单表达甘油运输蛋白可以有效提高甘油耐受性,促进菌体生长,单表达甘油脱氢酶可以提高二羟基丙酮的产量,但是同时过表达这两种膜结合酶时,DHA的产量并没有明显的提高,这有待进行下一步的探索。