背景与目的:肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一,其发病率仅次于膀胱癌,居泌尿系肿瘤的第2位。约30%的RCC患者在诊断原发肿瘤时已有转移灶,另外约30%-40%的患者术后一年内出现复发、转移。RCC是一种对放疗和化疗均不敏感的实体瘤,其病因和病理机制尚不完全清楚。虽然临床上对于中晚期肾癌的靶向治疗取得了非常可喜的临床疗效(国内外报道的疾病控制有效率均在80%左右),但临床上仍有一部分的患者出现疾病进展,影响了患者的长期存活。苹果酸舒尼替尼(Sunitinib)是一种常用的口服多靶点抗肿瘤药物,属于多靶点酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine Kinase Inhibitors,TKIs)。目前对于肿瘤的多重药物抵抗(Multidrug Resistance,MDR,)仍是治疗失败的主要因素,如何逆转肿瘤的药物抵抗,提高肿瘤细胞的药物敏感性,成为人们越来越关注的话题。有研究表明三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ATP-Binding Cassette Transporter superfamily G member 2,ABCG2),是位于细胞膜上的耐药相关半转运蛋白,起着“药物泵”的作用,与治疗药物在癌细胞内的浓度积累密切相关。有研究发现:肾癌细胞中ABCG2呈高表达,且与患者的存活率密切相关;同时Sunitinib也是ABCG2的作用底物,提示ABCG2可能是肾癌产生药物抵抗的重要因素之一。烟曲霉毒素C(Fumitremorgin C,FTC)被证明是ABCG2特异性抑制剂。本研究首先研究ABCG2在散发性肾癌人群中的表达情况。然后通过使用FTC特异性抑制ABCG2的功能,探讨Sunitinib对肾癌细胞的体外治疗效果;同时观察ABCG2抑制剂FTC联合Sunitinib在肾癌裸鼠皮下移植瘤模型中的治疗效果。材料和方法:1调取经病理证实为肾透明细胞癌的石蜡标本共120例和因肾积水失功的肾组织石蜡标本10例,切片后按照试剂盒标准程序进行ABCG2免疫组化染色。2经Western Blot法检测并选择ABCG2蛋白相对高表达的3珠肾癌细胞株,寻找这3株细胞株Sunitinib的IC50浓度,联合使用ABCG2的特异性抑制剂FTC和Sunitinib,采用CCK-8检测、流式细胞仪分析法观察联合治疗对这3种细胞株的存活率及凋亡水平;通过流式细胞术检测FTC处理前后肾癌细胞中Sunitinib的积累及外排比例;采用细胞克隆形成实验观察FTC处理前后细胞增殖水平;通过Transwell实验观察FTC处理对肾癌细胞迁移的影响。3取5周龄的雄性BLAB/c nu裸鼠18只,随机分为3组,分别为:空白对照组、Sunitinib单药组、Sunitinib+FTC联合组。使用瘤细胞悬液接种法建立786-O人肾癌裸鼠皮下移植瘤模型。药物干预如下:Sunitinib使用灌胃,一周5次连续2周,浓度控制在100 mg/kg体重;第15天起,联合治疗组给予0.1 ml FTC溶液于瘤体内少量多点注射,给药量20 nmol。37天后处死小鼠,观察肿瘤瘤体积和重量变化。结果:1在120例肾癌组织中,有63例ABCG2表达为阳性,阳性率为52.5%。阳性表达部位主要出现在癌细胞的细胞膜,呈棕黄色,条带状。在10例非肾癌组织中,ABCG2都呈阴性表达。采用Fisher精确概率分析结果显示:在肾癌组织和非肾癌组织中ABCG2表达的阳性率差异有统计学意义(P=0.001)。在肾癌组织中ABCG2的表达水平与患者的性别、年龄、肿瘤最大径、有无淋巴结转移、Furhman分级无关(P>0.05);而与是否有远处转移及5年存活率有关(P<0.05)。120例肾癌患者5年总生存率为80.8%,其中ABCG2阴性组为94.7%,ABCG2阳性组(+~+++)为68.3%,组间差异具有显著统计学意义(P<0.001)。两组的OS分别为86.3±22.5个月和61.4±33.0个月,P<0.001。2 ABCG2在786-O、ACHN、OS-RC-2这3种细胞株中呈相对高表达,舒尼替尼对于这3种肾癌细胞株的IC50在2μM左右。联合使用ABCG2的特异性抑制剂FTC和Sunitinib能有效抑制肾癌细胞增殖,平均抑制率分别为63.8%、46.3%、45.3%,在与786-O和OS-RC-2中跟Sunitinib单药组差异具有显著统计学意义(P<0.05)。联合应用能有效诱导癌细胞凋亡,凋亡率分别为13.5%、25.8%、17.4%,与单药组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。FTC处理后,癌细胞内Sunitinib平均积累率分别为:142.3%、151.7%、148.0%,而平均外排率分别为:74.9%、61.5%、69.7%,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。Sunitinib+FTC联合治疗组细胞克隆的形成数量明显减少(P<0.05);Transwell实验提示迁移的细胞数无明显变化。3成功构建786-O人肾癌裸鼠模型,按照实验方案进行药物干预(Sunitinib采用灌胃的方式,而FTC进行移植瘤局部皮下注射)。实验第37天进行动物处死及移植瘤的剥离,Sunitinib+FTC联合用药组的肿瘤体积明显小于Sunitinib单药组或空白对照组,分别为320.3mm3、582.0mm3和825.3mm3,组间差异具有显著统计学意义(P<0.01)。联合用药组的肿瘤重量明显小于Sunitinib单药组或空白对照组,分别为249.5mg、339.7mg、421.3mg,组间差异具有显著统计学意义(P<0.01)。Sunitinib+FTC联合治疗组相对于Suninib组的瘤重抑制率(%)IR为26.6%;Sunitinib相对于空白对照租的IR为16.0%。结论:1 ABCG2在肾癌组织中呈部分表达(52.5%),较非肾癌组织表达差异具有显著统计学意义。ABCG2的表达水平与肾透明细胞癌是否有远处转移及5年存活率有关(P<0.05)。2联合使用ABCG2的特异性抑制剂FTC和Sunitinib,具有体外抑制人肾癌细胞(786-O、ACHN、OS-RC-2)增殖的作用,并诱导癌细胞凋亡;但对癌细胞的迁移无明显影响。其机制可能是FTC抑制肾癌细胞表面的ABCG2的功能,从而提高Sunitinib药物在癌细胞内的药物浓度,最终增强了Sunitinib对肾癌细胞的杀伤、抑制作用。3 Sunitinib能够抑制786-O细胞在裸鼠皮下瘤体的增殖能力,同时发现ABCG2抑制剂FTC能够加强Sunitinib抑制肿瘤细胞的增殖。4本研究拟为临床克服肾癌药物靶向治疗障碍、提高肾癌对靶向药物的敏感性,提供了实验依据。