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癌症是目前危害人类健康和生命的高致命性疾病，其中化学治疗是主要治疗手段之一。但由于化学治疗药物对正常细胞的毒副作用以及肿瘤细胞耐药性的出现，寻找新型抗癌药物代替传统化学药物，势在必行。近年来，人们发现小分子多肽由于具有亲和力高，靶向特异性强，毒性低和分子量小等特点，其具有开发为新型肿瘤治疗药物的巨大潜力。值得一提的是，课题组前期通过化学合成获得了12条源于凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）血蓝蛋白的具有明显抗菌活性的化学合成肽段。生物信息学分析显示，这些肽段也可能具有抗肿瘤活性，但其具体的抗肿瘤活性及其作用机制尚不清楚。为此，本研究采用细胞生物学、分子免疫学、蛋白质组学等策略，对2种源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的化学合成肽段的抗肿瘤活性及其作用机制进行了较为深入的研究，所获主要研究结果如下：
1.肽段B1体外抗肿瘤活性及其作用机制研究
1）抗肿瘤活性
选取宫颈癌细胞（HeLa）、食管癌细胞（EC109）、肝癌细胞（HepG2）和乳腺癌细胞（MDA-MB-231）为细胞模型，采用MTS法分析肽段B1对肿瘤细胞的抑制作用。结果发现，肽段B1在体外对这4种肿瘤细胞的生长均具有明显的抑制作用，其中50μg/mL肽段B1处理HeLa、EC109、HepG2和MDA-MB-231细胞24h后，细胞活性分别下降为29.2%、50.8%、46.6%和73.5%，与阴性对照相比，存在极显著性差异（p<0.01）。
在此基础之上，进一步采用AnnexinV-FITC/PI双荧光染色和流式细胞术分析肽段B1的抗肿瘤活性。结果表明，3.125-50μg/mL肽段B1处理HeLa、EC109、HepG2和MDA-MB-231细胞24h后，细胞凋亡率分别为5.6-69.3%、10.4-89.2%、6.5-45.7%和8.1-89.8%，呈明显的剂量-效应关系。
这些结果提示，肽段B1在体外细胞水平具有抗肿瘤活性。
2）抗肿瘤作用机制
首先，采用APD3、DNAstarLasergene7.1和I-TASSER三个在线软件对肽段B1理化性质和结构进行预测，发现肽段B1可能具有两亲性α-螺旋结构，且带有正电荷，与既往报道的具有细胞渗透能力的肽段结构相似。
随后，以HeLa细胞为研究模型分析肽段B1对肿瘤细胞的渗透作用。流式细胞术分析发现，3.125-50μg/mLB1-FITC处理HeLa细胞6-48h后，B1-FITC标记细胞为0.2%-100%，呈明显的剂量-时间-效应关系。同时，激光共聚焦分析显示，50μg/mLB1-Rhodamine处理HeLa细胞24h后，B1-Rhodamine可以定位在细胞内部。由此说明，肽段B1可能能够渗透进入肿瘤细胞。
继而，运用Pull-down和LC-MS/MS技术对肽段B1相互作用蛋白进行分析。结果发现，Biotin-B1与HeLa细胞总蛋白孵育后，新增10条分子量为12-180kDa可能可以与肽段B1相结合的条带，经质谱鉴定、筛选，这些条带与包括Voltage-dependentanion-selectivechannelprotein1（VDAC1）在内的15个蛋白具有高度同源性，推测其可能为肽段B1的相互作用蛋白。在此基础之上，基于文献报道VDAC1在线粒体中具有控制代谢稳态和凋亡等功能，选取潜在结合蛋白VDAC1为研究对象，采用分子模拟对接技术对肽段B1与VDAC1之间的相互作用进行分析。结果发现，肽段B1能与VDAC1结合并形成稳定的结构。在此基础之上，进一步采用Pull-down、Westernblot技术分析肽段B1与VDAC1之间的相互作用。结果发现，与对照相比，Biotin-B1和HeLa细胞总蛋白孵育后，与抗VDAC1抗体呈明显的阳性反应。同时，采用基因克隆、原核表达、Pull-down和Westernblot等技术对肽段B1与rVDAC1之间的相互作用进行分析。结果显示，与对照组相比，Biotin-B1和GST-rVDAC1孵育后，与抗GST抗体呈明显阳性反应。这些结果说明，肽段B1应该能够与VDAC1发生相互作用。
其次，通过激光共聚焦技术对肽段B1的亚细胞定位进行分析。结果发现B1-Rhodamine能够与HeLa细胞线粒体共定位。由此推测，肽段B1进入HeLa细胞后的作用靶位可能为线粒体VDAC1蛋白。
接着，通过JC-1和DCFH-DA染色技术，分析肽段B1对线粒体膜电势（ΔΨm）和ROS的影响。流式细胞术分析发现，3.125-50μg/mL肽段B1处理HeLa细胞24h后，随着肽段B1浓度的增加，线粒体膜电势逐渐下降，而ROS逐渐上升，呈明显的剂量-效应关系。同时，激光共聚焦分析发现，50μg/mL肽段B1处理HeLa细胞24h后，线粒体膜电势丧失，ROS爆发。这些研究结果提示，肽段B1可能通过线粒体凋亡信号通路而诱导肿瘤细胞发生凋亡。
最后，采用Westernblot分析肽段B1对线粒体凋亡信号通路相关蛋白表达的影响。结果发现，3.125-50μg/mL肽段B1处理HeLa细胞24h后，Caspase-9、Caspase-3和Bax的表达量随着肽段B1处理浓度的增加而升高，Bcl-2表达量随着肽段B1处理浓度的增加而降低。
根据以上研究结果，推测肽段B1发挥抗肿瘤活性的作用机制可能为：肽段B1首先渗透进入细胞后与线粒体VDAC1蛋白相结合，继而促使细胞线粒体膜电势丧失、ROS爆发，最终通过线粒体介导的程序性凋亡机制发挥抗肿瘤作用。
2.肽段B11体外抗肿瘤活性及其作用机制研究
1）抗肿瘤活性
本研究以肿瘤细胞HeLa、HepG2、EC109和正常细胞THLE-3（人肝上皮细胞）为模型，首先采用MTS法分析肽段B11对肿瘤细胞的抑制作用。结果发现，50μg/mL肽段B11处理细胞24h后，与阴性对照相比，HeLa、HepG2和EC109细胞活性分别下降20.0%、23.0%和13%，存在显著性差异（p<0.05）；而对正常的THLE-3细胞基本无影响。
随后，采用显微观察和DAPI染色技术分析肽段B11对HeLa细胞形态和细胞核的影响。结果表明，肽段B11可使HeLa细胞数目明显减少，细胞出现皱缩、变圆、抱团等现象。同时，细胞核出现固缩、浓染等凋亡特征。
在此基础之上，进一步采用AnnexinV-FITC/PI双荧光染色和流式细胞术分析肽段B11的抗肿瘤活性。结果显示，50μg/mL肽段B11处理细胞8-48h后，细胞凋亡率为8.2-43.5%，呈明显的时间-效应关系。
以上结果表明，肽段B11与B1相似，其在体外同样具有抗肿瘤活性。
2）抗肿瘤作用机制
首先，采用APD3、DNAstarLasergene7.1和I-TASSER三个在线软件对肽段B11理化性质和结构进行预测分析。结果发现，肽段B11可能具有α-螺旋-β-折叠结构，且带有1个单位的正电荷，总疏水比为46%。由此提示，肽段B11可能具有细胞渗透作用。
继而，以HeLa细胞为研究模型，采用激光共聚焦技术对肽段B11的渗透作用和亚细胞定位进行分析。结果发现，50μg/mLB11-Rhodamine处理HeLa细胞24h后，B11-Rhodamine可以进入细胞内部，并能够与线粒体共定位。提示，肽段B11渗透进入细胞后，可能通过影响线粒体功能，进而诱导细胞发生凋亡。
接着，采用激光共聚焦技术分析肽段B11对HeLa细胞线粒体膜电势（ΔΨm）和ROS的影响。结果发现，与阴性对照相比，50μg/mL肽段B11处理HeLa细胞24h后，线粒体膜电势明显下降，细胞ROS爆发。
最后，采用Westernblot技术分析肽段B11作用HeLa细胞后线粒体凋亡相关蛋白的表达变化。结果显示，与阴性对照相比，Caspase-9、Caspase-3和Bax蛋白表达水平明显上升，而Bcl-2表达水平则显著下降。
这些结果表明，肽段B11发挥体外抗肿瘤作用机制可能同样为线粒体介导的程序性凋亡机制，不过可能与肽段B1在作用靶位方面存在差异。
综上所述，本研究首次发现源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的2个化学合成肽段B1、B11具有体外抗肿瘤活性，其作用机制可能为线粒体介导的程序性凋亡机制。所获结果为深入揭示对虾血蓝蛋白降解肽段的免疫学功能与作用机制奠定了良好的基础。同时，为血蓝蛋白潜在的临床应用以及抗肿瘤药物的筛选提供了新的策略和思路。
1.肽段B1体外抗肿瘤活性及其作用机制研究
1）抗肿瘤活性
选取宫颈癌细胞（HeLa）、食管癌细胞（EC109）、肝癌细胞（HepG2）和乳腺癌细胞（MDA-MB-231）为细胞模型，采用MTS法分析肽段B1对肿瘤细胞的抑制作用。结果发现，肽段B1在体外对这4种肿瘤细胞的生长均具有明显的抑制作用，其中50μg/mL肽段B1处理HeLa、EC109、HepG2和MDA-MB-231细胞24h后，细胞活性分别下降为29.2%、50.8%、46.6%和73.5%，与阴性对照相比，存在极显著性差异（p<0.01）。
在此基础之上，进一步采用AnnexinV-FITC/PI双荧光染色和流式细胞术分析肽段B1的抗肿瘤活性。结果表明，3.125-50μg/mL肽段B1处理HeLa、EC109、HepG2和MDA-MB-231细胞24h后，细胞凋亡率分别为5.6-69.3%、10.4-89.2%、6.5-45.7%和8.1-89.8%，呈明显的剂量-效应关系。
这些结果提示，肽段B1在体外细胞水平具有抗肿瘤活性。
2）抗肿瘤作用机制
首先，采用APD3、DNAstarLasergene7.1和I-TASSER三个在线软件对肽段B1理化性质和结构进行预测，发现肽段B1可能具有两亲性α-螺旋结构，且带有正电荷，与既往报道的具有细胞渗透能力的肽段结构相似。
随后，以HeLa细胞为研究模型分析肽段B1对肿瘤细胞的渗透作用。流式细胞术分析发现，3.125-50μg/mLB1-FITC处理HeLa细胞6-48h后，B1-FITC标记细胞为0.2%-100%，呈明显的剂量-时间-效应关系。同时，激光共聚焦分析显示，50μg/mLB1-Rhodamine处理HeLa细胞24h后，B1-Rhodamine可以定位在细胞内部。由此说明，肽段B1可能能够渗透进入肿瘤细胞。
继而，运用Pull-down和LC-MS/MS技术对肽段B1相互作用蛋白进行分析。结果发现，Biotin-B1与HeLa细胞总蛋白孵育后，新增10条分子量为12-180kDa可能可以与肽段B1相结合的条带，经质谱鉴定、筛选，这些条带与包括Voltage-dependentanion-selectivechannelprotein1（VDAC1）在内的15个蛋白具有高度同源性，推测其可能为肽段B1的相互作用蛋白。在此基础之上，基于文献报道VDAC1在线粒体中具有控制代谢稳态和凋亡等功能，选取潜在结合蛋白VDAC1为研究对象，采用分子模拟对接技术对肽段B1与VDAC1之间的相互作用进行分析。结果发现，肽段B1能与VDAC1结合并形成稳定的结构。在此基础之上，进一步采用Pull-down、Westernblot技术分析肽段B1与VDAC1之间的相互作用。结果发现，与对照相比，Biotin-B1和HeLa细胞总蛋白孵育后，与抗VDAC1抗体呈明显的阳性反应。同时，采用基因克隆、原核表达、Pull-down和Westernblot等技术对肽段B1与rVDAC1之间的相互作用进行分析。结果显示，与对照组相比，Biotin-B1和GST-rVDAC1孵育后，与抗GST抗体呈明显阳性反应。这些结果说明，肽段B1应该能够与VDAC1发生相互作用。
其次，通过激光共聚焦技术对肽段B1的亚细胞定位进行分析。结果发现B1-Rhodamine能够与HeLa细胞线粒体共定位。由此推测，肽段B1进入HeLa细胞后的作用靶位可能为线粒体VDAC1蛋白。
接着，通过JC-1和DCFH-DA染色技术，分析肽段B1对线粒体膜电势（ΔΨm）和ROS的影响。流式细胞术分析发现，3.125-50μg/mL肽段B1处理HeLa细胞24h后，随着肽段B1浓度的增加，线粒体膜电势逐渐下降，而ROS逐渐上升，呈明显的剂量-效应关系。同时，激光共聚焦分析发现，50μg/mL肽段B1处理HeLa细胞24h后，线粒体膜电势丧失，ROS爆发。这些研究结果提示，肽段B1可能通过线粒体凋亡信号通路而诱导肿瘤细胞发生凋亡。
最后，采用Westernblot分析肽段B1对线粒体凋亡信号通路相关蛋白表达的影响。结果发现，3.125-50μg/mL肽段B1处理HeLa细胞24h后，Caspase-9、Caspase-3和Bax的表达量随着肽段B1处理浓度的增加而升高，Bcl-2表达量随着肽段B1处理浓度的增加而降低。
根据以上研究结果，推测肽段B1发挥抗肿瘤活性的作用机制可能为：肽段B1首先渗透进入细胞后与线粒体VDAC1蛋白相结合，继而促使细胞线粒体膜电势丧失、ROS爆发，最终通过线粒体介导的程序性凋亡机制发挥抗肿瘤作用。
2.肽段B11体外抗肿瘤活性及其作用机制研究
1）抗肿瘤活性
本研究以肿瘤细胞HeLa、HepG2、EC109和正常细胞THLE-3（人肝上皮细胞）为模型，首先采用MTS法分析肽段B11对肿瘤细胞的抑制作用。结果发现，50μg/mL肽段B11处理细胞24h后，与阴性对照相比，HeLa、HepG2和EC109细胞活性分别下降20.0%、23.0%和13%，存在显著性差异（p<0.05）；而对正常的THLE-3细胞基本无影响。
随后，采用显微观察和DAPI染色技术分析肽段B11对HeLa细胞形态和细胞核的影响。结果表明，肽段B11可使HeLa细胞数目明显减少，细胞出现皱缩、变圆、抱团等现象。同时，细胞核出现固缩、浓染等凋亡特征。
在此基础之上，进一步采用AnnexinV-FITC/PI双荧光染色和流式细胞术分析肽段B11的抗肿瘤活性。结果显示，50μg/mL肽段B11处理细胞8-48h后，细胞凋亡率为8.2-43.5%，呈明显的时间-效应关系。
以上结果表明，肽段B11与B1相似，其在体外同样具有抗肿瘤活性。
2）抗肿瘤作用机制
首先，采用APD3、DNAstarLasergene7.1和I-TASSER三个在线软件对肽段B11理化性质和结构进行预测分析。结果发现，肽段B11可能具有α-螺旋-β-折叠结构，且带有1个单位的正电荷，总疏水比为46%。由此提示，肽段B11可能具有细胞渗透作用。
继而，以HeLa细胞为研究模型，采用激光共聚焦技术对肽段B11的渗透作用和亚细胞定位进行分析。结果发现，50μg/mLB11-Rhodamine处理HeLa细胞24h后，B11-Rhodamine可以进入细胞内部，并能够与线粒体共定位。提示，肽段B11渗透进入细胞后，可能通过影响线粒体功能，进而诱导细胞发生凋亡。
接着，采用激光共聚焦技术分析肽段B11对HeLa细胞线粒体膜电势（ΔΨm）和ROS的影响。结果发现，与阴性对照相比，50μg/mL肽段B11处理HeLa细胞24h后，线粒体膜电势明显下降，细胞ROS爆发。
最后，采用Westernblot技术分析肽段B11作用HeLa细胞后线粒体凋亡相关蛋白的表达变化。结果显示，与阴性对照相比，Caspase-9、Caspase-3和Bax蛋白表达水平明显上升，而Bcl-2表达水平则显著下降。
这些结果表明，肽段B11发挥体外抗肿瘤作用机制可能同样为线粒体介导的程序性凋亡机制，不过可能与肽段B1在作用靶位方面存在差异。
综上所述，本研究首次发现源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的2个化学合成肽段B1、B11具有体外抗肿瘤活性，其作用机制可能为线粒体介导的程序性凋亡机制。所获结果为深入揭示对虾血蓝蛋白降解肽段的免疫学功能与作用机制奠定了良好的基础。同时，为血蓝蛋白潜在的临床应用以及抗肿瘤药物的筛选提供了新的策略和思路。