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背景和目的：同源盒基因在胚胎发育中调节细胞的生长、分化和迁移，gax（growth arrest homeobox）基因是一个主要存在于心血管系统的同源盒基因。血管壁中gax基因表达在球囊损伤后快速下调，在受有丝分裂原刺激后由G0期向G1期转变的血管平滑肌细胞（VSMC）中也明显降低，其降低程度与有丝分裂原刺激DNA合成的能力有关。gax基因在VSMC中的这种表达模式与gas（growth arrest-specific）基因和gadd（growth arrest and DNA damage-inducible）基因相似，后二者中的一些基因表达增强时可抑制细胞生长，说明gax基因对VSMC的生长和增殖可能起着抑制作用。考虑到VSMC的增殖、迁移以及凋亡失调在血管成形术后再狭窄病灶新生内膜形成中起着重要作用，本实验通过构建携带gax基因的重组腺病毒载体并转染体外培养的VSMC，研究gax基因表达增强后VSMC增殖、迁移和凋亡等生物学行为所受影响及其机制，从而探讨增强gax基因表达对血管成形术后再狭窄的作用和意义。 方法：（1）采用位置特异性重组方法构建携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体，经293细胞扩增，纯化制备高滴度病毒转染液。（2）采用组织块贴壁法原代培养大鼠主动脉VSMC。（3）以病毒转染液常规转染VSMC后，应用RT-PCR、流式细胞仪和免疫细胞化学等方法分别检测gax基因在VSMC转录和翻译水平的表达。（4）应用四唑盐（MTT）比色试验、3H标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入试验、流式细胞仪、改良Boyden’s小室和TUNEL染色观察gax基因表达增强对VSMC增殖、迁移和凋亡的影响。（5）应用免疫细胞化学染色和RT-PCR技术观察gax基因转染后，VSMC表达p21、p27、增殖细胞核抗原（PCNA）、细胞周期蛋白依 腺病毒介导gax基因转染对血管平滑肌细胞生物学行为的影响及机制探讨 赖性激酶2K X连接蛋白43KX43X基质金属蛋白酶2（MMPZX骨桥 蛋白、Bax和Bcl－2的变化。 结果：＊）本实验应用 DNA重组技术，成功地构建了携带 gax基因的 重组质粒载体 pDC31唱ax，将其作为穿梭质粒与腺病毒基因组质粒 pBHGlox A EI，3Cre通过脂质体介导共转染 293细胞，通过位置特异性重 组，成功获得携带gax基因的复制缺陷型腺病毒重组体AdCMV唱ax。构建 的 AdCMV唱ax通过大量复制和纯化，获得病毒滴度约 5 X ibfujml，最 佳感染复数（MOI）为50。 p)经细胞形态学和免疫细胞化学方法鉴定，应用大鼠主动脉原代培 养所得细胞为VSMC。 O)流式细胞仪检测和免疫细胞化学染色均显示AdCMV仑ax转染 VSMC后，VSMC的Gax蛋白表达率明显增高，转染后24小时即可达80％ 左右，高水平的表达可维持5天以上。 以)AdCMV名ax转染前，PDGF七B对gax基因转录和翻译水平的表达 均有下调作用，接近正常生理浓度的PDGF－BBp／ml即可使VSMC的 Gax蛋白表达率由36．拟％显著降低至22．83％（P＜0刀5），随着PD＊＊＊B浓度 的升高，gax基因表达下降程度更加显著；AdCMV唱ax转染后，无论有无 ＊D＊卜＊B刺激，V＊＊C中ggy基因的表达均比转染前显著增高。 O八dCMV唱ax转染使VSMC表达gax增强后，VSMC的MTT吸光：度值和切了dR掺入量均较未转染组显著降低，G。刀；期的 VSMC比例较 未转染组显著增高P功．01)，民一M期和S期细胞比例显著降低P功力1卜 问AdCMV吧ax转染使 VSMC的 pZI和 p27表达比未转染组显著增高， CDKZ和 PCNA表达比未转染组显著降低，CX43蛋白表达基本恢复至有丝 分裂原刺激前状态。 ＊AdCMV名ax转染使VSMC表达gax增强后，VSMC迁移数较未转 染组显著减少，并随转染时间延长减少更加明显。 仰AdCMV名ax转染后MMPZ和骨桥蛋白表达比未转染组显著降低。 O)无AdCMV唱ax转染时，无论有无PDGFEB刺激，均无或仅可见 ·Vll· 第三军医大学博士学位论文极少量的TUNEL染色阳性细胞；AdCMV唱ax转染后，如无PDGF石B刺激，也无或仅可见少量的TUNEL染色阳性细胞，予PDGF－BB刺激后，TUNEL染色阳性细胞显著增多，以2448小时最为明显。 ＊)无AdCMV唱ax转染时，无论有无PDGFBB刺激，Bax蛋白表达均很低，而Bcl上蛋白表达则较高；AdCMV名ax转染后，如无PDGF丑B刺激，Bax和BclZ蛋白表达近似于转染前，予PDGFBB刺激后，Bax蛋白表达显著增高o动刀5)，BC12蛋白表达显著降低(规对 1卜 结论：1．PDGFBB刺激使gax基因在细胞转录和翻译水平的表达均下降，且随PDGF书B浓度的升高，gax基因表达下降程度更加显著。 2．本实验构建的复制缺陷型腺病毒重组体AdCMV名ax转染VSMC后可显著增强gax基因在VSMC的表达。 3．AdCMV名ax转染使VSMC表达gax增强后，可抑制由有丝分裂原刺激所引