论文部分内容阅读
研究新型抗肿瘤药物6’-羟基爵床素A (6’-hydroxy justicidin A, JR6)对HepG2细胞的内质网应激及胞内钙离子浓度变化的影响及其作用机制,为研发具有自主产权、低毒性、高效应的肿瘤化合物提供可信具体的实验依据和理论基础。①MTT法检测JR6对HepG2细胞活性的影响。②激光扫描共聚焦显微镜测JR6作用24h后细胞内静息钙浓度变化及IP3R钙泵抑制剂光溜海绵素C干预后JR6的作用变化。③GENMED内质网高质染色试剂盒对不同剂量JR6作用24h后的HepG2细胞进行染色,激光共聚焦显微镜观察染色后不同分组内HepG2细胞内质网形态的变化。④采用蛋白印迹(western blot)法检测加入受试药24h后HepG2细胞中IRE1, GRP78/BiP, Bcl-2蛋白表达量的变化。⑤RT-PCR技术法检测加入受试药24h后HepG2细胞中XBP-1mRNA表达量的变化。⑥蛋白印迹(western blot)法检测加入受试药24h后HepG2细胞中caspase-3蛋白表达变化⑦FCM法检测caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK干预后JR6诱导HepG2细胞凋亡的作用变化。①JR6对HepG2细胞活性的影响明显。②加入受试药JR6后,HepG2细胞内钙离子浓度明显增高,IP3R钙泵抑制剂能阻断JR6升高HepG2细胞内钙离子的作用。③加入受试药JR6后,HepG2细胞内质网活动加剧。④IRE1, Bip, Bcl-2蛋白的表达量与加入JR6剂量负相关。⑤RT-PCR结果显示XBP-1mRNA的表达量随加入JR6剂量的增加而减少。⑥蛋白印迹结果显示caspase-3蛋白表达量与加入JR6的剂量正相关,加入抑制剂Z-DEVD-FMK后caspase-3蛋白几乎无表达。⑦FCM检测结果显示JR6能明显诱导HepG2凋亡,caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK干预后JR6诱导HepG2细胞凋亡的作用降低。JR6对HepG2细胞具有显著的抑制作用。JR6通过影响Bcl-2蛋白调节内质网钙通道IP3R的开放,引起HepG2细胞内的钙浓度升高,破坏细胞内的钙稳态；同时IRE1蛋白表达变化标志着JR6引起了内质网应激,启动未折叠蛋白反应的关键因子GRP78/BiP, XBP-1mRNA被JR6抑制,ERS不能通过正常程序被终止。当ERS过长过强时,HepG2细胞趋向凋亡。