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金属硫蛋白(Metallothionein,MT)是一类富含半胱氨酸(cysteine,Cys)且具有结合重金属能力的低分子量蛋白,广泛存在于动物、植物、蓝细菌和真菌等生物中。本研究从甘蔗ROC22组培苗中克隆获得5个金属硫蛋白基因的cDNA序列,还从ROC22自交所获得的成熟种子中克隆了 1个该类基因的cDNA序列。构建含有上述金属硫蛋白基因的表达载体并分别转入酵母中,对重组酵母在铜、镉重金属胁迫下的表型进行鉴定,进一步通过实时荧光定量PCR研究甘蔗MTs基因的组织表达特性及其对外界胁迫的响应特点。主要研究结果如下:1.甘蔗金属硫蛋白家族基因的克隆与序列分析本研究从甘蔗ROC22 spp.hybrid cv.ROC22)组培苗的叶片中获得了 5个新的MT基因,分别命名为:ScMT1-1、ScMT2-1-5、ScMT3-1、ScMT7和 其序列长度分别为 456 bp、448 bp、419 bp、318 bp 和 373 bp,其ORF 长度分别为 228 bp、252 bp、198 bp、237 bp 和 237 bp,其 GenBank 登录号分别为 KU950383、KU950385、KU950384、KU950387 和 KU950388。从甘蔗ROC22成熟种子中获得了 1个新的MT基因,命名为ScMT4,其序列长度为251 bp,其ORF长度为159 bp,其GenBank登录号为KU950386。根据MTs氨基酸序列中的特征氨基酸(半胱氨酸,Cys)的排列特征,上述6个MT基因分别属于金属硫蛋白家族 Type 1(ScMT1-1),Type 2(ScMT2-1-5),Type 3(ScMT3-1),Type 4 而ScMT,MT7和Srn0与该家族已经报道的4个类型均不同,可能属于新类型的植物金属硫蛋白。2.重金属胁迫培养对重组酵母生长的影响构建含有上述金属硫蛋白基因的表达载体并分别转入毕赤酵母(Pichia pastoris)中,研究重组酵母在含有铜(50 μmol/L、100μmol/L 和 150μmool/L)或镉(200 μnol/L、400 μmol/L 和 600 μmol/L Cd2+)的 YPDS 培养基平皿上的生长情况。转ScMT1-1重组酵母和转ScMT2-1-5重组酵母在Cd2+和Cu2+胁迫条件下的长势与对照相比没有明显差异,表明ScMT1-1基因和ScMT2-1-5基因在重组酵母抵抗Cd2+和Cu2+胁迫过程中不起积极的作用;转ScMT3-1重组酵母在含有Cd2+和Cu2+培养平皿上的长势均明显优于对照,表明该基因在酵母响应Cd2+和Cu2+胁迫过程中发挥积极作用;转ScMT4重组酵母在Cd2+和Cu2+胁迫条件下的长势与对照酵母相比均无明显改善,表明该基因在酵母抵抗Cd2+和Cu2+胁迫过程中不起积极作用;转ScMT7重组酵母在Cd2+胁迫条件下的长势未见优于对照酵母菌株,但其在Cu2+胁迫条件下的长势略微优于对照酵母菌株,表明该基因在酵母响应Cd2+胁迫过程中未起到积极的作用,但在响应Cu2+胁迫过程中起到积极的作用。3.甘蔗金属硫蛋白家族基因的表达模式分析ScMTs的组织特异性表达检测结果表明:在成熟甘蔗中,ScMT1-1基因主要在叶中表达,其表达量约为蔗髓中的27.6倍;ScMT2-1-5基因主要在甘蔗茎分生组织中表达,其表达量约为蔗髓中的5.17倍;ScMT3-1基因主要在叶中表达,其表达量约为蔗髓中的3.37倍;ScMT4仅在甘蔗成熟的种子中表达;Sc和ScMT10在芽中的表达最高,其表达量分别约为蔗髓中的47.04倍和23.36倍。ScMTs基因对不同外源胁迫的应答存在基因型的差异,提示了该基因家族各成员存在功能上的分化。具体表现在:ScMT1-1基因受水杨酸(salicylic acid,SA)和H2O2的正向调控;主要参与了甘蔗地上部对聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)渗透胁迫的正向应答;此外,该基因对甘蔗重金属Cd2+和Cu2+胁迫的应答不显著。ScMT2-1-5基因受脱落酸(ABA)和茉莉酸甲酯(MeJA)的负向调控,但受水杨酸(salicylic acid,SA)正向调控;该基因对PEG渗透胁迫的响应呈正向相关,且在甘蔗地下部中该正向应答趋势较其在地上部中更加稳定;而该基因主要在甘蔗地上部中稳定参与了对重金属Cu2+胁迫的正向应答;此外,该基因对H2O2和NaCl胁迫的应答有浓度特异性。ScMT3-1基因受ABA、MeJA和SA的正向调控,且上述三种外源激素处理对该基因的诱导表达总体上呈现剂量效应;ScMT3-1的表达受到H202胁迫的诱导,但受到NaCl胁迫的抑制;该基因在甘蔗地下部响应PEG胁迫中起积极的作用,其中,在高浓度(25%)PEG诱导下,其表达量高达对照的14.55倍;此外,Cu2+胁迫总体上诱导了该基因的轻微上调表达,且在甘蔗地下部中该诱导上调的趋势较其在地上部中明显;与Cu2+胁迫不同,该基因主要在甘蔗地上部中参与了对重金属Cd2+胁迫的正向应答。ScMT7基因的表达受MeJA和SA的正向调控;该基因表达受到H2O2胁迫的诱导,但受到NaCl胁迫的抑制;该基因在甘蔗地上部响应PEG胁迫中起积极的作用;,在低浓度(10%)PEG诱导下,其表达量高达对照的325.83倍;此外,该基因主要在甘蔗地上部中参与了对重金属Cd2+胁迫的正向应答;还同时在甘蔗的地上部和地下部中参与了对重金属Cu2+胁迫的正向应答,其表达量最高达到对照的41.44倍。ScMT10基因的表达受ABA和MeJA的负向调控,其对SA胁迫的应答有浓度特异性;该基因表达分别受到H2O2和NaCl胁迫的抑制,其中NaCl胁迫的抑制作用显著;该基因在甘蔗地上部和地下部中均对PEG胁迫呈显著的正向响应;此外,重金属Cu2+和Cd2+胁迫均抑制了该基因在甘蔗(地上部和地下部)的表达水平。