背景足细胞,即肾小球脏层上皮细胞,附着在肾小球基底膜的表面,参与肾小球滤过屏障的构成。足细胞的胞体能伸出许多足突,足突之间相互连接形成裂孔,裂孔之间覆盖有裂孔隔膜蛋白,形成一道物理性屏障。足细胞的损伤和凋亡可直接导致肾小球滤过屏障功能受损,对多种肾脏损伤(包括糖尿病肾脏病)均有重要意义。糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)的主要微血管并发症之一。据国际糖尿病协会(international diabetes federation,IDF)2010年研究统计,全球共有2.85亿DM患者,并且预测在2030年将达到4.39亿。值得我们注意的是,流行病学研究显示,如今发展中国家DM患病率的增长速度比发达国家的更加快速。随着DM的发病趋势在全球范围内快速上升,DKD在全球的发病趋势不容忽视。在发达国家,DKD已经成为终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)的首要原因,约占ESRD.总病例数的50%,也是肾脏替代治疗(包括肾脏移植和肾脏透析治疗)的第一位原发病。而在中国,随着DM的流行趋势飞速增长,DKD作为DM的主要微血管并发症,其患病率也快速上升,严重影响了DM患者的生活质量。DKD是指由慢性高血糖引起的慢性肾脏疾病,在2007年由美国肾脏病基金会(national kidney foundation, NKF)建议替代传统专业术语糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)。DKD的发病机制十分复杂,多条信号通路及多种因素参与其中,目前仍未被阐明清楚。当前认为,遗传易感性、肾小球血流动力学异常、慢性高血糖、晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)增多、多元醇通路激活、蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)途径异常激活、免疫炎症反应以及氧化应激均参与了DKD的发生发展。目前国内外研究一致认为,蛋白尿,尤其是微量白蛋白尿,是糖尿病导致肾脏损伤的可检测的最早期的临床特征之一。而足细胞作为肾小球滤过屏障的构成部分之一,逐渐成为糖尿病肾脏病相关研究的热点。众多研究显示,肾小球足细胞损伤和凋亡在糖尿病肾脏病的发生发展中发挥着关键作用。无论是1型还是2型糖尿病,在糖尿病肾脏病早期,足细胞即急剧凋亡,并同时出现微量白蛋白尿,提示足细胞凋亡是糖尿病肾脏病的早期病变之一。因此,抑制足细胞凋亡对防治早期糖尿病肾脏病具有重要价值。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(Renin-angiotensin-aldosterone system, RAAS)对糖尿病肾脏病的进展有着重要意义。在糖尿病状态下,RAAS系统被过度激活,导致血管紧张素转换酶活性异常增高,血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)表达增多,直接参与了肾脏的进行性损害。多项研究表明AngⅡ可以诱导足细胞凋亡,而且其促凋亡作用与刺激时间和刺激剂量呈正相关。国内学者研究发现,AngⅡ可通过增强p38MAPK信号通路诱导足细胞凋亡。此外,肾脏局部RAS系统被激活,AngⅡ生成增多,增加毛细血管静水压,对足细胞有牵拉作用,导致足细胞损伤及其增生能力下降。国外动物实验也显示,腹腔注射AngⅡ可导致大鼠高血压和蛋白尿的发生,电镜下可见足细胞足突融合、裂孔消失,足细胞凋亡明显增加。因此,RAAS系统的过度激活对足细胞的凋亡也有重要意义。转化生长因子-β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)是一种经典的多功能细胞因子,与细胞增殖、分化及凋亡等多种细胞活动密切相关,在肾小球纤维化的进程中发挥重要作用。Schiffer等发现TGF-β1能够通过激活p38MAPK信号通路诱导足细胞凋亡,而且在TGF-β1转基因小鼠身上可观察到,TGF-β1过表达可激活SMAD (sma-and MAD-related)蛋白家族最终导致小鼠肾小球硬化。丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen active protein kinase,MAPK)是一类丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,主要包括p38MAPK(p38 mitogen active protein kinase, p38MAPK)、c-Jun-N末端激酶(c-jun amino-terminal kinase,JNK)、细胞外信号调控的蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinase mediates, ERK)等主要亚型,是介导细胞外信号到细胞内的重要信号转导系统,共同调节细胞的基因表达、代谢、存活和分化等多个细胞活动。越来越多的研究表明,p38MAPK信号通路的激活与DKD的发生发展密切相关。糖尿病状态下,MAPK可被应激或炎症因子激活,进一步磷酸化下游的转录因子,调控靶基因表达,参与DKD的发生发展。国外研究指出,醛固酮可激活p38MAPK信号通路进而诱导大鼠足细胞凋亡。而抑p38MAPK磷酸化,可减少活性氧簇产生,明显改善足细胞损伤和凋亡。可见,p38MAPK通路的激活在足细胞凋亡进程中起着重要作用。贝前列素钠(beraprost sodium,BPS)是一种稳定的前列环素(prostacyclin, PGI2)类似物,具有扩张血管、抗血小板凝集、抗炎等药理作用。研究发现,BPS可通过拮抗AngⅡ对出球小动脉的收缩作用进而能够有效减少糖尿病大鼠肾脏的尿白蛋白排泄,并且能够降低p38MAPK信号通路活性,抑制]TNF-α、TGF-β1、MMP-9等多种炎症因子的生成,对肾脏起到保护作用。Li等也认为BPS可能通过抑p38MAPK信号活化来减少糖尿病心肌细胞凋亡,具有细胞保护作用。但是,BPS是否能够体外抑制足细胞凋亡,国内外尚未见相关研究报道。因此,本研究以小鼠肾小球足细胞为研究对象,观察BPS对AngⅡ诱导小鼠足细胞凋亡的影响,探讨BPS对足细胞的保护作用及可能的机制。具体研究包括以下两部分：第一章贝前列素钠对血管紧张素Ⅱ诱导的足细胞凋亡的影响目的1.观察培养的条件永生化小鼠足细胞在不同环境下的形态学变化,掌握细胞培养的基本操作过程。2.观察不同浓度BPS对AngⅡ环境下小鼠肾小球足细胞MPC5细胞活性的影响。3.观察不同浓度BPS对AngⅡ环境下小鼠肾小球足细胞MPC5细胞凋亡的影响。4.观察不同浓度BPS对AngⅡ环境下小鼠肾小球足细胞MPC5细胞中caspase3蛋白活化表达的影响。方法1.细胞培养：实验细胞为条件永生化小鼠肾小球足细胞系(conditionally immortalized mouse podocyte cell line,MPC5),由南方医科大学珠江医院肾病中心实验室转赠。未分化的小鼠足细胞用含10 U/mL的重组小鼠γ-干扰素(γ-interferon,IFN-γ)的RPMI1640培养基在33℃、5%C02培养箱中传代培养,每2-3天传代一次；用不含IFN-γ的RPMI1640培养基在37℃、5% CO2培养箱中诱导分化,分化10-14天后可用于实验。2.细胞分组：分化成熟的足细胞采用无血清的RPMI1640培养基培养24h以使细胞生长同步化,平衡后细胞分组如下：正常对照组(Control组,纯RPMI1640培养基培养),血管紧张素Ⅱ组(AngⅡ组,AngⅡ浓度为10-7mol/L),AngⅡ联合不同浓度的BPS组：AngⅡ浓度为10-7mol/L,BPS浓度分别为1μmol/L(μM),2μM, 5μM。倒置显微镜下观察不同处理组的MPC5细胞形态学变化。3.不同处理组(Control组、AngⅡ组及AngⅡ联合不同浓度BPS组)MPC5细胞分别培养24h、48h后用CCK-8法测定细胞活性。4.不同处理组的MPC5细胞培养24h,收集1×106个细胞,采用Annexin V-FITC/PI双染法染色,上流式细胞仪进行足细胞凋亡的检测。5.不同处理组MPC5细胞培养24h,免疫印迹法检测;aspase3舌化蛋白的表达。6.采用SPSS19.0软件对实验数据进行统计学分析,统计结果用均数±标准差(n=3,x±s)进行描述。采用析因方差分析方法进行主效应和交互效应的分析；计量资料进行正态性检验,各处理组均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),任意两组间比较,当满足方差齐性时采用LSD法(Least-significant difference test),否则,用Welch法校正,采用Dunnett’s T3法进行组间多重比较。P<0.05被认为差异具有统计学意义。结果1.不同处理组足细胞分别培养24h、48h后,各处理组足细胞O.D值均有显著差异(24h:F=899.009,P<0.001:48h:F=51.341)。与Control组比较,24h及48h的AngⅡ组的足细胞O.D.值均显著降低,差异均具有统计学意义(P均<0.001)。不同浓度BPS组与AngⅡ组比较,24h及48h的足细胞O.D.值均显著增加,差异均具有统计学意义(24h 1μMBPS:P=0.013;其余P均<0.001)。2.不同处理组足细胞培养24h后,不同处理组间的足细胞凋亡率有显著差异(F=7.320, P=0.005), AngⅡ组凋亡率为(6.43±1.42)%,与对照组比较,细胞凋亡率升高,差异具有统计学意义(P=0.001)；不同浓度BPS组的足细胞凋亡率分别为(4.17±1.58)%、(3.03±0.40)%、(2.80±0.52)%,与AngⅡ组比较,各浓度BPS组细胞凋亡均显著降低,差异均具有统计学意义(P均<0.05)。3.AngⅡ刺激24h后,与对照组相比,AngⅡ组的足细胞中活化后的caspase3即cleaved caspase3(c-casp3)蛋白表达明显增多(P=0.003)。统计分析显示,不同处理组足细胞cleaved caspase3 (c-casp3)/caspase3(casp3)蛋白相对表达有显著差异(F=14.991,P=0.010)。与AngⅡ相比,不同浓度BPS培养足细胞,随着BPS药物浓度的增加,足细胞cleaved caspase3蛋白表达逐渐减少,差异均具有统计学意义(1μMBPS:P=0.018; 2μMBPS:P=0.005; 5μMBPS:P=0.003)。结论1.BPS能够有效增强AngⅡ环境下小鼠足细胞的活性,对足细胞可能有保护作用。2.BPS能够有效抑AngⅡ诱导的小鼠足细胞凋亡,在一定浓度范围内,该效应随着BPS浓度升高而增强。3.BPS能够有效抑带AngⅡ诱导的小鼠足细胞凋亡,可能与减少AngⅡ环境下caspase3蛋白的活化有关。第二章 贝前列素钠经p38MAPK信号通路抑制血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠足细胞凋亡目的1.观察不同浓度BPS及SB203580对Angll环境下小鼠足细胞TGF-β1蛋白、p38MAPK蛋白磷酸化的表达的影响。2.观察p38MAPK抑制剂SB203580对AngⅡ诱导足细胞凋亡的影响,探讨p38MAPK信号通路是否参与了BPS对Angll诱导足细胞凋亡的调节。方法1.细胞培养同第一章2.细胞处理分组：Control组：1640培养基正常培养Angll组：以终浓度为10-7mol/L的Angll孵育足细胞5μMBPS组：以终浓度为为10-7mol/L的AngⅡ及：5μmol/L的BPS共同孵育SB203580抑制(SB)组：以p38MAPK特异抑制剂SB203580预孵育1h,再以Angll培养MPC5细胞为SB抑制剂组。3.应用免疫印迹法分别检测10min,15min,30min,60min不同时间点Angll培养条件下小鼠足细胞系MPC5细胞p38MAPK磷酸化蛋白的表达。4.选取Angll环境下足细胞p38MAPK磷酸化蛋白增强表达最显著的时间点,应用免疫印迹法分别检测该时间点Angll联合不同浓度BPS或SB203580对足细胞p38MAPK磷酸化蛋白的表达。5.分别以CCK-8检测24h、48h各不同处理组(包括Control组、Angll组、5μMBPS组及SB组)足细胞活性。6.用AnnexinV-FITC/PI双染法染色,上流式细胞仪检测24h不同处理组(包括Control组、Angll组、5μMBPS组及SB组)MPC5细胞的凋亡。7.应用免疫印迹法,检测各处理组(包括Control组、Angll组、5μMBPS组及SB组)24hMPC5细胞的caspase3蛋白活化的表达。9.采用SPSS19.0软件对实验数据进行统计学分析,统计结果用均数±标准差(n=3,x±s)进行描述。采用析因方差分析方法进行主效应和交互效应的分析；计量资料进行正态性检验,各处理组均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),任意两组间比较,当满足方差齐性时采用LSD法(Least-significant difference test),否则,用Welch法校正,采用Dunnett’s T3法进行组间多重比较。P≤0.05被认为差异具有统计学意义。结果1.AngⅡ刺激0min(AngⅡ0’)细胞仅有少量磷酸化p38MAPK蛋白表达,AngⅡ刺激15 min(AngⅡ 15’)后p38MAPK磷酸化蛋白表达显著增强(P=0.002),刺激30min(AngⅡ30’)后p38MAPK磷酸化蛋白的表达开始减弱,刺激60 min(AngⅡ60’)磷酸化p38MAPK信号仍有少量表达。2.选取AngⅡ刺激15min进一步实验。SB203580能够有效地阻止AngⅡ诱导足细胞p38 MAPK磷酸化蛋白的表达(P=0.001)。与AngⅡ相比,除1μM外,其他浓度BPS培养足细胞,随着BPS药物浓度的增加,足细胞p38MAPK磷酸化蛋白表达逐渐减少,差异均有统计学意义(2μMBPS:P=0.045; 5μMBPS: P=0.017)。经SB203580抑制p38MAPK磷酸化后,SB组p38MAPK磷酸化表达较AngⅡ组显著降低(P=0.001),与对照组和5μMBPS组相比,均无显著差异(对照组：P=0.499; 5μMBPS:P=0.182)。3.SB203580能够有效增强AngⅡ环境下足细胞的细胞活性(CCK-8法测定),有效抑制AngⅡ诱导的足细胞凋亡(AnnexinV-FITC/PI双染法),显著减少caspase3蛋白的活化表达,差异均具有统计学意义(P均<0.01)。结论BPS能够有效保护AngⅡ环境下的小鼠足细胞,抑制caspase3活化以减少其凋亡,其机制可能与p38MAPK通路的抑制相关。