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背景:强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种常见的慢性炎症性疾病,可累及骶髂关节、中轴关节、外周关节以及肌腱韧带骨附着点,以炎性腰背部、髋部等关节疼痛为主要临床特点。炎症是导致AS发生骨破坏的关键因素之一,炎症反复发作,可导致肉芽组织增生、新骨形成,最终使受累韧带及关节逐渐发展成纤维性和骨性强直,导致脊柱“竹节样”、骶髂关节融合、关节强直畸形等后果,使患者丧失工作能力甚至生活自理能力。因此,控制AS炎症对于控制病情发展、保护关节功能、防止致残从而提高患者生存质量的十分必要。辅助性T细胞17(Thelper 17 cell,Th17)作为效应T细胞的重要成分,参与多种炎症反应的发生,也是介导AS炎症发生的核心效应细胞。Th17细胞可以分泌白细胞介素 17(interleukin 17,IL-17)、白细胞介素21(interleukin 21,IL-21)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNFα)等多种细胞因子,但IL-17是Th17的标志性细胞因子,也是Th17细胞发挥致炎作用的主要效应途径。IL-17可通过与不同细胞上的IL-17受体(IL-17R)结合刺激多种细胞产生多种致炎性因子,开启多种致炎途径。因此,抑制Th17细胞的分化和功能,减少IL-17分泌,是治疗AS炎症有重要意义的靶点。初始CD4+T细胞(Naive CD4+T cell)在不同细胞因子刺激下,表达不同的特异性转录因子,分别向辅助性T细胞1(Thelper 1 cell,Th1)、辅助性T细胞2(Thelper 2 cell,Th2)、调节性T细胞(Tregulatory cell,Treg)和Th17等不同亚群分化。其中,维甲酸相关孤儿受体γt(retinoid-acid receptor-related orphan receptorγt,RORγt)作为Th17的特异性转录因子,是Th17细胞分化所必需的关键转录因子。RORyt由RORc基因编码,抑制RORc基因的转录和RORγt表达,是调控Th17分化过程中的关键环节。最新研究发现,转录共激活因子TAZ(transcriptional co-Activator with PDZ-binding motif,TAZ)是RORyt最重要的转录共激活因子,RORγt通过配体结合区域与TAZ结合后能增强自身转录活性,从而促进Th17分化,发挥致炎作用。TAZ是Hippo信号通路下游的主要效应因子,其活性受Hippo信号通路各级信号因子调控。Hippo信号通路是一条高度保守的生长抑制性通路,因具有调控细胞增殖、分化和凋亡,控制器官大小的功能,自发现以来一直是肿瘤领域的研究热点。随着研究的深入,Hippo信号通路在免疫系统中的调控作用逐渐被揭示。哺乳动物不育系20样激酶 1/2(mammalian sterile 20-like kinases 1/2,MST1/2)和核Dbf2相关激酶1/2(nuclear Dbf2-related kinases 1/2,NDR1/2)构成Hippo信号通路的核心激酶,并通过上下游级联磷酸化反应来负性调控TAZ水平。目前,TAZ作为Th17特征异性转录因子RORyt关键转录共激活因子,其影响Th17分化偏移的作用是确切的,而Hippo信号通路作为TAZ的上游调控通路,可能在AS炎症中起重要作用。临床中活动期AS患者常见湿热瘀阻型,辨证论治可予清热利湿活血法治之。前期临床研究发现,清热利湿活血法能有效控制AS炎症以及病情活动程度。前期完成的国家十一五科技支撑计划重大疑难病研究中,采用冯兴华教授创立的清热利湿活血法代表方清热强脊汤治疗活动期AS,国际ASAS20/50/70有效率分别为86.75%、60.68%和41.45%,临床疗效满意。且前期多项研究表明,清热利湿活血法可以通过多靶点有效抑制Th17分化偏移,减少IL-17分泌,发挥抗炎作用。根据以上论述,我们推测清热利湿活血法可能是通过活化Hippo信号通路进而抑制TAZ转录共激活作用,或直接抑制TAZ转录共激活作用,降低转录因子RORyt表达,从而抑制初始CD4+T细胞向Th17分化偏移,发挥抗AS炎症的作用。目的:探究AS患者转录共激活因子TAZ及其上游Hippo信号通路调控Th17分化偏移的分子机制;探索清热利湿活血法治疗活动期AS患者是否通过Hippo信号通路调控TAZ影响Th17分化发挥抗炎作用。方法:研究一、研究二纳入活动期AS患者(AS-Active)30例,稳定期AS患者(AS-Stable)20例,健康志愿者(Normal)20例。记录患者一般情况、血清C反应蛋白(CRP)水平和血沉(ESR)水平及BSDAI评分。取肘窝静脉血后,采用Ficoll-hypaque密度梯度离心法分别收集血清及外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组血清IL-17表达水平;用蛋白免疫印迹法(western blot,WB)检测各组 PBMC 中 MST1/2、NDR1/2、TAZ 及 RORyt 的蛋白表达情况;用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测各组PBMC 中 MST1/2、NDR1/2、TAZ 及 RORc 的 mRNA 表达情况。研究三纳入活动期AS患者30例,观察清热利湿活血法治疗前后CRP、ESR水平及BASDAI评分的变化;ELISA法检测治疗前后患者血清IL-17表达水平;WB检测治疗前后患者PBMC中TAZ、RORγt以及MST1/2的蛋白表达情况。结果:1.活动期AS患者血清中IL-17表达量较稳定期AS患者及正常对照组均显著增高(p<0.01),差异有统计学意义,而稳定期AS患者较正常组虽有所升高,但无统计学意义(p>0.05)。采用Spearman相关系数进行相关性检验,发现IL-17水平与炎症活动指标ESR、CRP及BASDAI评分均显著正相关(IL-17-ESR:r=0.586,p<0.001;IL-17-CRP:r=0.422,p=0.020<0.05);IL-17-BASDAI:r=0.450,p=0.013<0.05)。活动期AS患者RORc mRNA及蛋白与正常对照组相比,表达均显著升高(p<0.01);与稳定期AS患者相比,活动期AS患者RORc mRNA及蛋白表达也均呈显著升高(p<0.01);稳定期AS患者与正常对照组比较,RORc mRNA表达明显升高(p<0.05),RORyt蛋白表达未见显著差异(p>0.05)。活动期AS患者TAZ蛋白表达水平,较正常对照组以及稳定期AS患者均显著升高(p<0.01);稳定期AS患者与正常对照组相比,TAZ蛋白表达水平亦明显升高,差异有统计学意义(p<0.01);在基因水平,活动期AS患者TAZ mRNA表达较正常对照组和稳定期AS患者均显著升高(p<0.01),稳定期AS患者与正常对照组相比,TAZ mRNA表达情况并无显著差异。进行相关性检验后,发现TAZ表达水平与炎症活动指标ESR、CRP均显著正相关(TAZ-ESR:r=0.409,p=0.031<0.05;TAZ-CRP:r=0.362,p=0.039<0.05);TAZ 表达水平与 BASDAI并无显著相关性(r=0.272,p=0.161>0.05)。TAZ表达水平与血清IL-17、RORyt表达均呈显著正相关(p<0.01)。2.与正常对照组相比,活动期AS患者MST1蛋白及mRNA表达较均显著降低(p<0.01);与稳定期AS患者相比,活动期AS患者MST1蛋白表达显著降低,mRNA表达差异无统计学意义(蛋白:p<0.01;mRNA:p>0.05);稳定期AS患者与正常对照组比较,MST1蛋白及mRNA表达均明显降低(蛋白:p<0.05;mRNA:p<0.01)。与正常对照组相比,活动期AS患者MST2蛋白及mRNA表达均显著降低(p<0.01);与稳定期AS患者相比,活动期AS患者MST2蛋白表达明显降低,mRNA表达差异无统计学意义(蛋白:p<0.01;mRNA:p>0.05);稳定期AS患者与正常对照组比较,MST2 mRNA及蛋白表达均明显降低(蛋白:p<0.05;mRNA:p<0.01)。与正常对照组相比,活动期AS患者NDR1蛋白及mRNA表达均显著降低(p<0.01);与稳定期患者AS患者相比,活动期AS患者NDR1蛋白表达明显降低,mRNA表达差异无统计学意义(蛋白:p<0.01;mRNA:p>0.05)。稳定期AS患者与正常对照组比较,NDR1蛋白表达无差异,mRNA表达明显下降(蛋白:p>0.05;mRNA:p<0.05)。与正常对照组相比,活动期AS患者NDR2蛋白及mRNA表达均显著降低(p<0.01);与稳定期AS患者相比,活动期AS患者NDR2蛋白表达明显降低,mRNA表达差异无统计学意义(蛋白:p<0.05;mRNA:p>0.05);稳定期AS患者与正常对照组比较,NDR2蛋白表达差异无统计学意义,mRNA表达明显降低(蛋白:p>0.05;mRNA:p<0.01)。采用Spearman相关系数进行相关性检验,发现MST1/2、NDR1/2水平与TAZ水平均呈显著负相关(MST1-TAZ:r=-0.585,p<0.001;MST2-TAZ:r=-0.588,p<0.001;NDR1-TAZ:r=-0.506,p<0.001;NDR2-TAZ:r=-0.428,p<0.001)。3.活动期AS患者经清热利湿活血法治疗12周后,炎症指标ESR、CRP较治疗前下降明显(p<0.01);疾病活动指数BASDAI评分较治疗前亦明显下降(p<0.01)。经清热利湿活血法治疗12周后,活动期AS患者RORyt、TAZ蛋白表达较治疗前均明显下降(p<0.01),活动期AS患者MST1、MST2蛋白表达较治疗前均明显升高(p<0.01)。结论:1.AS患者PBMC中TAZ表达水平明显升高,并且与疾病炎症指标及Th17的分化及功能高度相关,说明转录共激活因子TAZ与RORyt结合,增强转录因子RORγt表达,从而促进Th17分化偏移,可能是导致AS炎症发生的重要机制之一。2.AS患者PBMC中MST1/2、NDR1/2表达水平明显降低,说明Hippo信号通路处于关闭状态,解除对TAZ的抑制作用,激活转录共激活子TAZ表达,从而促进RORγt转录活性,促进Th17分化偏移,可能是调控AS炎症的重要机制之一。3.清热利湿活血法通过增强上游MST1/2激酶的表达,活化Hippo信号通路,抑制TAZ转录共激活作用,进而抑制Th17细胞的特异性转录因子RORγt表达,参与调控Th17分化偏移,抑制IL-17分泌,可能是其发挥抗AS炎症的重要机制之一。