转基因动物是生物学研究领域的重要材料,筛选标记基因被广泛应用于转基因动物的生产过程中,然而筛选标记的残留存在生物安全隐患。利用Cre/Loxp重组系统可以实现删除筛选标记基因的目的。本实验构建了pEGFP-N1-LacS载体,通过电转染方法使该载体与体外转录所得的phiC31整合酶mRNA共同转染了奶牛胎儿皮肤成纤维细胞,使LacS基因定点整合入奶牛胎儿皮肤成纤维细胞基因组上,筛选出稳定转染的表达绿色荧光的阳性细胞株。再利用Cre穿膜肽对表达绿色荧光的阳性细胞进行孵育,切除筛选标记基因,获得稳定转染的无绿色荧光的细胞系,为培育无筛选标记基因的转LacS基因克隆奶牛奠定基础。主要结果概括如下：1.以pEGFP-N1为骨架载体,将合成的；attB序列和优化的LacS基因克隆入pEGFP-N1,并在相应位置利用PCR引物添加同方向的两个Loxp序列,构建了真核表达载体p-EGFP-N1-LacS。2.将p-EGFP-N1-LacS质粒和phiC31整合酶mRNA通过电转染的方法共转染奶牛胎儿皮肤成纤维细胞,使目的基因定点整合入奶牛基因组,经过400μg/mL G418筛选出表达绿色荧光的细胞系。3.将pET-28a(-)-His-NLS-TAT-Cre质粒转化BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达Cre重组蛋白,经过纯化得到Cre穿膜肽,利用Cre穿膜肽对表达绿色荧光的细胞株进行37-C孵育,切除标记基因。筛选出去除筛选标记基因的无绿色荧光的细胞系,即得到可定点整合并且无筛选标记转LacS的奶牛细胞系。