人凝血因子Ⅶ在肝脏内合成,是一种参与凝血过程的重要单链糖蛋白。当组织发生破损的时候血液中的组织因子（TF）暴露出来,FⅦ通过与其相结合形成TF-FⅦ复合物而激发外源性凝血途径,同时内源性凝血途径的启动也受到FⅦ的调控。凝血因子Ⅶ在治疗先天性和获得性FⅦ缺乏疾病、带有FⅧ和FⅨ抑制物的血友病、血小板功能性障碍和血小板减少疾病,以及外科及严重意外创伤的止血等方面具有十分广泛的应用。然而,FⅦ属于血浆微量蛋白,在人体内的正常含量只有200～400ng/ml。因此,为了获得FⅦ的高表达以及随后规模化的制备,在本研究中,通过利用连续三次抓捕技术实现了人EEF1A1-人FⅦ杂合基因座的构建,并在293FT细胞中实现了FⅦ的表达,为哺乳动物细胞系表达大载体提供了探索性研究。本研究包括以下2个方面：1.人EEF1A1-人FⅦ杂合基因座的构建以pBR322为骨架,插入通过全基因合成在一起的6个同源臂以及Kana,neo等筛选标记,构建得到pBR322-GAPREPAIR三次连续抓捕载体。通过RED同源重组系统,在E.coli内进行缺口修复,依次在含有人EEF1A1和人FⅦ的BAC上抓捕得到人EEF1A1的3’调控区序列、人FⅦ的基因组、人EEF1A1的5’调控区序列,得到pBR322-5’hEEF1A1-hFVII-3’hEEF1A1重组子.经过PCR扩增.限制性内切酶消化和测序验证,我们得到约50kb的人EEF1A1-人FⅦ杂合基因座,原人EEF1A1基因组编码序列从起始密码子到终止密码子在构建的杂合基因座中被人FⅦ基因组序列精确置换。2.人EEF1A1-人FⅦ杂合基因座在293FT细胞中的表达首先将构建得到的pBR322-5’hEEF1A1-hFⅦ-3’hEEF1A1重组子酶切线性化,电击转染进293f细胞系,通过600mg/ml的G418压力筛选,得到抗性细胞。对通过G418抗性筛选得到的混合细胞克隆进行基因组和mRNA的提取,应用PCR检测目的基因的整合及转录情况,结果表明构建的人EEF1A1-人FⅦ合基因座整合进入了293FT细胞基因组,并且成功转录。随后通过对收集的细胞上清进行ELISA检测后发现,表达产物中有凝血因子Ⅶ的存在。在本研究中,我们成功构建了人EEF1Al-人FⅦ杂合基因座,并在哺乳动物细胞中实现了FⅦ的表达,为今后哺乳动物细胞系表达大载体的研究奠定了基础。