[目 的]酒精性肝病(Alcoholic liver disease,ALD)是一种严重危害人类健康的疾病,其患病率在世界范围内逐年增加,是一个全球性的公共卫生问题。为此,深入研究ALD的发病机制和探索其干预策略具有十分重大的意义。骨髓间充质干细胞(Bone marrow-mesenchymal stem cells,BM-MSCs)是一种来源于中胚层的多能成体细胞,其具有高度自我更新和多向分化的潜能,被广泛用于多种疾病的基础和临床研究。本研究旨在探讨小鼠BM-MSCs移植对酒精性肝损伤小鼠的疗效及其相关的分子机制。[方 法]本研究分为两个部分:第一部分:小鼠BM-MSCs的分离、培养、鉴定及慢病毒转染1.采用全骨髓贴壁法,从4～6周龄的雄性C57BL/6N小鼠后肢骨髓中分离出干细胞;2.采用流式细胞仪检测所分离出的干细胞表面的免疫分子标志物,包括CD29、CD45、CD90 和 CD105;3.对所分离出的干细胞进行成骨和成脂诱导分化培养,判断其多向分化潜能;4.采用慢病毒转染的方法将小干扰核糖核酸(Small interfering ribonucleic acid,siRNA)导入所分离出的BM-MSCs中,并通过逆转录定量聚合酶链式反应(Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和蛋白质印迹(Westem-blot,WB)方法检测肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)α刺激基因/蛋白(TNF-α stimulating gene/protein,TSG)6的表达,制备稳定的BM-MSCs转染株。第二部分:小鼠BM-MSCs对小鼠酒精性肝损伤的疗效及机制研究1.实验动物与分组:8～10周龄、体重17～21克、雌性C57BL/6N小鼠70只,随机分成以下七组:正常组、模型组、MSCs组、sc-MSCs组、siTSG6-MSCs组、rmTSG-6组和AG490组,每组10只小鼠,分别给予对照液体饲料和酒精液体饲料喂养;2.酒精性肝损伤模型:本研究根据美国国立卫生院酒精滥用与成瘾研究所(National institute of alcohol abuse and alcoholism/national institute of health,NIAAA)的方法建立酒精性肝损伤模型,即通过慢性酒精液体饲料喂养10天联合三次高剂量酒精灌胃的方法诱导雌性小鼠酒精性肝损伤模型;3.干细胞移植:在造模期第10天,正常组、模型组、MSCs组、sc-MSCs组、siTSG6-MSCs组、rmTSG-6组和AG490组实验小鼠分别给予腹腔注射无菌生理盐水(正常组、模型组)、正常BM-MSCs(MSCs组)、转染对照慢病毒的BM-MSCs(sc-MSCs组)、转染干扰慢病毒的BM-MSCs(siTSG6-MSCs组)、重组小鼠TSG-6(rmTSG-6 组)、正常 BM-MSCs 联合 AG490(AG490 组);4.取材:在造模期第11天,将所有小鼠灌胃处理9小时后,再行吸入麻醉后采集血液和肝组织标本;5.标本检测:对各组小鼠血清和肝组织标本进行生化、组织病理学、流式细胞术、RT-qPCR及WB等检测。[结果]第一部分:小鼠BM-MSCs的分离、培养、鉴定及慢病毒转染1.采用全骨髓贴壁法分离出的干细胞,形态为三角形、梭形、纺锤形,呈放射状或漩涡状生长;细胞表面免疫标志物CD45表达率仅为0.65%,而CD29、CD90和CD105的表达率分别高达82.84%、85.27%、84.17%;细胞能被诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞,经油红O染色和茜素红染色后呈阳性,符合BM-MSCs的鉴定标准。2.小鼠BM-MSCs经干扰慢病毒转染后,TSG-6基因在转录和翻译水平显著下调,提示小鼠BM-MSCs TSG-6稳定转染株成功建立。第二部分:小鼠BM-MSCs对酒精性肝损伤的疗效及机制研究1.与正常组小鼠相比,模型组小鼠肝/体重比、血清谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)和谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、血清和肝组织总胆固醇(Total cholesterol,TC)和甘油三酯(Triglyceride,TG)、肝组织脂质过氧化产物丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、血清和肝组织促炎性介质白介素(Interleukin,IL)6和TNF-α的水平显著升高,肝组织中性粒细胞和巨噬细胞浸润明显增加,而肝组织抗氧化剂还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、抗炎性细胞因子IL-10和TSG-6的水平显著降低,这些结果提示酒精性肝损伤小鼠造模成功。2.经BM-MSCs治疗后,小鼠肝/体重比、血清转氨酶(ALT、AST)、血清和肝组织脂质(TC、TG)、肝组织MDA、血清和肝组织促炎性介质(IL-6、TNF-α)的水平、肝组织中性粒细胞和巨噬细胞浸润明显降低,而肝组织GSH、血清和肝组织抗炎性介质(IL-10、TSG-6)的水平明显升高,这些结果均提示小鼠BM-MSCs移植能有效治疗小鼠酒精性肝损伤。3.MSCs组、sc-MSCs组和siTSG6-MSCs组小鼠肝组织中仅有少数BM-MSCs归巢、定植。4.转染干扰慢病毒、下调TSG-6基因表达导致BM-MSCs对酒精性肝损伤的疗效显著降低,而转染对照慢病毒、不影响TSG-6基因表达对BM-MSCs的疗效没有影响,且外源性注射重组小鼠TSG-6(recombinant mouse TSG-6,rmTSG-6)的疗效与注射正常BM-MSCs的相似,提示TSG-6分子是小鼠BM-MSCs治疗酒精性肝损伤小鼠的关键分子。5.与正常组小鼠相比,模型组小鼠肝组织中的磷酸化信号转导子和转录激活子3(Phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3,p-STAT3)蛋白水平显著升高;经正常BM-MSCs治疗后,小鼠肝组织中的p-STAT3蛋白水平显著降低;转染干扰慢病毒、下调TSG-6基因表达导致BM-MSCs对小鼠肝组织p-STAT3蛋白水平的抑制作用消失,而转染对照慢病毒、不影响TSG-6基因表达对BM-MSCs的这一作用没有影响,且外源性注射rmTSG-6也能显著抑制小鼠肝组织中的p-STAT3蛋白水平,这些结果证实小鼠BM-MSCs是通过TSG-6分子来抑制小鼠肝组织中STAT3信号通路活化的。6.与MSCs组相比,AG490组小鼠肝组织中的p-STAT3蛋白水平显著降低;AG490组小鼠血清转氨酶(ALT、AST)、血清和肝组织脂质(TC、TG)、肝组织MDA水平显著降低,而肝组织抗氧化剂GSH水平显著增高,这些结果提示进一步抑制肝组织中的STAT3信号通路活化可以提高小鼠BM-MSCs对酒精性肝损伤小鼠的疗效。[结论]1.采用全骨髓贴壁法,能从小鼠后肢骨髓成功分离、提取BM-MSCs。2.通过慢病毒转染的方法,能成功建立稳定的TSG-6基因干扰株BM-MSCs。3.小鼠BM-MSCs移植能有效治疗小鼠酒精性肝损伤。4.小鼠BM-MSCs主要通过旁分泌机制、产生TSG-6分子发挥对酒精性肝损伤小鼠的疗效。5.小鼠BM-MSCs是通过TSG-6分子抑制小鼠肝组织中STAT3信号通路活化的,进一步抑制该信号通路活化可提高BM-MSCs的疗效。