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第一章microRNA介导的表观遗传学调节与遗传多态性联合对DDAH1表达的影响研究研究背景心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)是严重危害人类健康主要一大类疾病。心血管疾病病死率始终居我国居民死因首位,且呈不断上升趋势。深入研究的心血管疾病的发病机制是寻找新型心血管疾病防治药物、降低心血管疾病死亡率的重要前提,意义重大。血管内皮功能障碍是高血压病、冠心病和脑卒中等多种心脑血管疾病共同的病理生理基础。非对称性二甲基精氨酸(Asymmetric Dimethylarginine, ADMA)是一种内源性一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)抑制物,能竞争性地抑制NOS的活性,降低NO的生成,进而导致血管内皮功能障碍。血浆ADMA水平升高是心血管事件发生新的风险因子和心血管疾病预后的独立预测因子。人体内的ADMA80%经二甲基精氨酸二甲胺水解酶(包括DDAH1和DDAH2)水解。DDAH1是代谢血管内皮以及循环血液中ADMA关键酶。体内DDAH1酶的表达和活性的变化可能通过影响ADMA的代谢进而影响NOS的活性和NO的水平参与心血管疾病发生发展过程。DDAH1遗传多态性是影响体内DDAH酶活性和表达的因素之一,DDAH1基因的遗传多态性与血浆ADMA浓度及高血压、冠心病、缺血性脑卒中等多种心血管疾病的发生密切相关。microRNA (miRNA)是一类长约21-25个核苷酸的小分子非编码RNA,具有序列特异性,通过与靶基因mRNA分子3’端非翻译区域(3’-untranslated region,3’UTR)特异性结合,转录后调控其翻译。基因组遗传多态性可影响miRNA与靶基因的结合,进而影响miRNA对靶基因的调控。我们推测miRNA的序列特异性及转录后调控机制可能是DDAH1多态性调控其基因表达和酶活性的分子机制之一。本研究通过报告基因实验和SNP功能分析,探讨DDAH1基因的多态性及其相关miRNAs在心血管疾病的可能分子机制。方法1.荧光素酶报告基因实验对DDAH1SNP的功能进行分析PCR扩增DDAH13’端未翻译区(3’-untranslated region,3’-UTR)与高血压和冠心病发病风险呈阳性关联的SNP的序列,将携带不同等位基因的3’-UTR区段克隆入荧光素酶报告基因质粒,以pRL-SV40载体为内参,将两种质粒混合转染人脐静脉内皮细胞株(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC-C)或和HepG2细胞。使用双荧光素酶报告实验体系测定荧光素酶活性,分析和比较含不同等位的3’-URR列的转录活性。2.人脐静脉内皮细胞株HUVEC中miRNA模拟物和抑制剂对携带DDAH13’-UTR SNP序列质粒报告基因活性的影响PCR扩增含不同等位基因的3’-UTR区段并克隆入pGL3-Control质粒中,以pRL-SV40载体为内参,两种质粒分别与miR-660、miR-218、 miR-455-5p模拟物(40nM)或抑制剂(80nM)共同转染人脐静脉内皮细胞株HUVEC-C24、时后,双荧光素酶报告实验测定荧光素酶活性,分析和比较含不同等位的3’-UTR序列在miR-660、miR-218、miR-455-5p模拟物或抑制剂处理下的报告基因活性。3. miRNA模拟物和抑制剂对人脐静脉内皮细胞株HUVEC-C DDAH1蛋白表达和ADMA代谢活性及浓度的影响分别使用miR-660、miR-218、miR-455-5p模拟物(5、10、20、40nM)及其抑制剂(80nM)转染人脐静脉内皮细胞株HUVEC-C24h后,western-blot检测DDAH1蛋白表达,ELISA检测细胞内夕ADMA浓度以及ADMA代谢活性。分析和比较DDAH1表达、ADMA代谢活性及浓度。4.培养原代人脐静脉内皮细胞观察SNP的功能分离和培养原代人脐静脉内皮细胞HUVECs, PCR-RFLP对脐静脉组织DDAH1SNP位点进行基因分型,第4代内皮细胞于6孔板中培养24小时后,real-time PCR检测DDAH1mRNA表达,western-blot检测DDAH1蛋白表达,ELISA检测细胞内外ADMA浓度以及ADMA代谢活性。分析和比较DDAH1不同基因型个体HUVECs DDAH1表达、ADMA代谢活性及浓度。5.采集健康志愿者外周血单个核细胞(PBMCs)观察SNP的功能空腹抽血并分离正常健康志愿者外周血单个核细胞,PCR-RFLP对志愿者DNA样本DDAH1SNP位点进行基因分型,real-time PCR检测DDAH1mRNA表达,分析和比较DDAH1不同基因型个体mRNA表达水平。结果(1) HUVEC-C和HepG2细胞转染了pGL3-rs233113T质粒的HUVEC-C荧光素酶表达活性显著高于pGL3-rs233113A质粒(p<0.01)；转染了pGL3-rs233112G质粒的HUVEC-C荧光素酶活性显著低于pGL3-rs233112A质粒(p<0.01)(2)在HUVEC-C和HepG2细胞中,转染miR-660抑制剂(80nM)可显著升高pGL3-rs233113A质粒的荧光素酶活性(p<0.05); miR-660抑制剂(80nM)组处理HUVEC-C细胞可升高DDAH1蛋白表达。(3)在HUVEC-C和HepG2细胞中,转染40nMmiR-218模拟物转染可显著降低pGL3-rs233112A质粒的荧光素酶活性(p<0.01)；而在HepG2细胞中40nMmiR-218模拟物可显著降低pGL3-rs233112G质粒荧光素酶活性(p<0.01)。80nM miR-218抑制剂可显著升高内皮细胞中pGL3-rs233112G质粒的荧光素酶活性(p<0.05)。miR-218模拟物(20nM、40nM)可降低内皮细胞DDAH1蛋白表达和显著抑制DDAH活性(p<0.01),显著升高细胞内ADMA的浓度(p<0.01)。(4)在HUVEC-C和HepG2细胞中,miR-455-5p模拟物(40nM)和抑制剂(80riM)均可显著降低pGL3-rs233112A质粒的荧光素酶活性(p<0.01)。niR-455-5p模拟物(10nM、20nM、40nM)均可显著降低内皮细胞DDAH1蛋白表达和DDAH活性(p<0.01)；升高细胞内ADMA浓度(p<0.01)。(5)通过对收集的27根不同个体的脐带进行原代HUVEC培养。携带rs233113T等位的HUVEC(AT=10, TT=5)细胞内DDAH1mRNA表达、DDAH1蛋白表达以及ADMA代谢活性显著高于基因型为rs233113AA的内皮细胞(n=12)(p<0.05),而细胞内ADMA的浓度显著低于基因型为rs233113AA的内皮细胞(p<0.05)。(6)通过对收集的27根不同个体的脐带进行原代人脐静脉内皮细胞培养。基因型为rs233112GG型(n=4)的内皮细胞DDAH1mRNA、蛋白表达以及DDAH活性显著高于基因型为rs233112AA的内皮细胞(n=8)(p<0.05),而细胞内ADMA的浓度显著低于基因型为rs233112AA的内皮细胞(p<0.01)。(7)携带rs233113T等位(rs233113ATn=11, rs233113TTn=4)的个体PBMCs DDAH1mRNA表达显著高于rs233113AA型(n=17)个体(p=0.032)。结论1.DDAH1是miR-660、miR-218和miR-455-5p的靶基因；2.DDAH1rs233112多态性通过影响miR-218和miR-455-5p对DDAH1的表达和活性调控,从而影响细胞内ADMA的代谢。3.DDAH1rs233113多态性通过影响miR-660对DDAH1的表达和活性调控,从而影响细胞内ADMA的代谢。第二章miR-21介导4-HNE对内皮细胞DDAH1表达的下调研究背景非对称性二甲基精氨酸(Asymmetric Dimethylarginine, ADMA)是一种内源性一氧化氮合酶(NOS)抑制物,除了调节一氧化氮(nitric oxide, NO)生成外,还能诱导氧化应激,促进炎症反应,诱导内皮细胞凋亡。血浆ADMA水平升高是心血管事件发生新的风险因子和心血管疾病预后的独立预测因子。人体内80%的ADMA经二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH1和DDAH2)水解,DDAH1是代谢灭活血管内皮和循环中ADMA的关键酶。MicroRNA (miRNA)是一类长约21-25个核苷酸的高度保守的小分子非编码RNA,在细胞分化、增殖、凋亡中起重要调控作用。miRNA能通过与靶基因mRNA分子3’端非翻译区域(3’-untranslated region,3’-UTR)特异性序列互补配对,在转录后调控其翻译。MiR-21是一种广泛分布于体内各组织和器官的miRNA,与心血管疾病密切相关。通过软件预测发现DDAH1是MiR-21的靶点之一。4-羟基壬烯醛(4-hydroxy-2E-nonenal,4-HNE)是脂质过氧化的主要活性产物,具有高度的脂溶性。4-HNE是致动脉粥样硬化因子之一。4-HNE可剂量依赖地与DDAH1173位组氨酸形成micheal加合物,抑制DDAH1活性,从而降低NO的生成产量。本研究通过在HUVEC模型中研究4-HNE是否可通过直接调节DDAH1蛋白表达的方式上调细胞内ADMA水平,以及与miR-21的关系；并探讨4-HNE与DDAH/ADMA通路的关系及相关microRNA在心血管疾病发展过程的可能分子机制。方法1.miR-21模拟物转染HUVEC-C观察对miR-21表达、DDAH1/2表达、ADMA代谢活性及浓度的影响使用不同浓度miR-21模拟物(50nM、100nM)转染HUVEC-C不同时间点(12h,24h,48h)后,real-time PCR检测DDAH1mRNA表达,western-blot检测[DDAH1蛋白表达,ELISA检测细胞内外ADMA浓度以及ADMA代谢活性。2.4-HNE处理及miR-21抑制剂转染HUVEC-C观察miR-21表达、DDAH1表达、ADMA代谢活性及浓度的变化使用不同浓度4-HNE (1、5、10μM)处理HUVEC-C,其中一组10μM4-HNE处理组预先1小时转染miR-21抑制剂,另单独转染miR-21抑制剂一组。real-time PCR检测DDAH1mRNA和miR-21表达,western-blot检测DDAH1蛋白表达,ELISA检测细胞内外ADMA浓度以及ADMA代谢活性。结果(1)转染miR-21模拟物均可显著升高HUVEC-C miR-21表达(p<0.01)；转染miR-21模拟物12h、24h和48h后DDAH1和DDAH2mRNA表达和蛋白及细胞内ADMA代谢活性均显著降低(p<0.05)；而细胞内ADMA浓度显著升高(p<0.05),但不影响细胞外ADMA的浓度。(2)4-HNE处理HUVEC-C24h后可显著降低DDAH1/2mRNA表达和ADMA代谢活性以及升高细胞内ADMA浓度(p<0.05);10μmol/L4-HNE处理HUVEC-C24h可显著升高pri-miR-21和miR-21的表达,降低DDAH1蛋白表达(p<0.05);5μmol/L和10μmol/L4-HNE处理组细胞内、外ADMA浓度均显著升高(p<<0.05)。(3)转染miR-21抑制剂可逆转4-HNE所致DDAH1mRNA和蛋白表达的下调(p<0.05),部分恢复10μmol/L4-HNE所致细胞内ADMA代谢活性降低和细胞内ADMA浓度的升高(p<0.05,)；单独转染miR-21抑制剂对DDAH1表达及ADMA代谢活性及浓度无显著影响。结论1.miR-21对DDAH1/2的表达及活性具有抑制性调节；2.病理浓度的4-HNE可显著升高HUVEC细胞内miR-21表达,下调HUVEC细胞内DDAH1的表达,降低细胞内ADMA代谢活性,升高细胞内ADMA浓度,该作用可被miR-21抑制剂所逆转。