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干旱引起植物水分胁迫,从而对植物的生长、光合作用、气孔运动、呼吸作用、营养代谢等产生不良影响,进而影响植物的生长发育。干旱胁迫下植物最先表现为植株失水及气孔相关生理生化特性的变化,通过调控气孔的导度和开度来减少植株的蒸腾作用和水分丧失是植物应答干旱胁迫的一种重要机制。质膜H+-ATPase是调控气孔开度的关键酶,在水分胁迫下质膜H+-ATPase活性的变化是植物适应水分胁迫的重要指标之一。14-3-3蛋白是在真核细胞中发现的一类高度保守的调控蛋白,它可以通过与磷酸化质膜H+-ATPase的C末端相互作用而调节其活性。质膜H+-ATP酶的磷酸化水平受许多环境因素的调节,用离体蚕豆表皮条的研究表明H202能够抑制质膜H+-ATPase的磷酸化及与14-3-3蛋白的结合从而抑制质膜H+-ATPase的活性,减少H+的泵出并抑制保卫细胞质膜内向K+通道,促进气孔关闭。C4植物耐旱性比C3植物强,玉米是一种典型的C4植物,不同玉米杂交种在水分胁迫时,气孔阻力明显增大,以减少体内水分的散失,不同品种的气孔阻力增加的幅度不同,抗旱性强的增加幅度较大,而抗旱性差的增加幅度较小,本研究用PEG模拟干旱处理两个云南玉米栽培种（一种为黄皮玉米简称黄玉米（YM）,另一种白皮玉米简称白玉米（WM））,通过分析干旱胁迫下两种玉米叶片生理生化特性的变化、14-3-3蛋白和质膜H+-ATP酶的表达和互作与其活性的相关性,考察14-3-3蛋白和质膜H+-ATP酶在玉米响应干旱胁迫中的作用机理,取得以下主要研究结果：1.在水培条件下用聚乙二醇（PEG）模拟干旱胁迫处理YM和WM,分析叶片生理特性变化与14-3-3蛋白和质膜H+-ATP酶的表达、互作及质膜H+-ATP酶活性的相关性。结果表明在2%、5%和10%的PEG处理条件下,随处理浓度和时间的增加,两种玉米幼苗植株失水率上升,叶片蒸腾速率降低,气孔传导率下降；在所有相同处理条件下,WM植株失水率明显小于YM,而叶片蒸腾速率和气孔传导率下降幅度明显大于YM,说明WM的耐旱性比YM强。在相同浓度PEG处理条件下,WM叶片可溶性蛋白、可溶性糖含量、游离脯氨酸含量均高于YM,说明WM在干旱胁迫下的渗透调节能力强于YM；在抗氧化酶体系中,随着PEG胁迫浓度的升高,两种玉米叶片CAT活性呈下降趋势,但WM的CAT活性在2%和5%PEG胁迫下均显著高于YM,在三种PEG处理浓度下WM叶片的POD活性都高于YM,这使其叶片中H2O2含量显著低于YM。随着PEG胁迫浓度的升高,WM叶片质膜H+-ATPase磷酸化水平及其与14-3-3蛋白的结合受到的抑制作用比YM强,WM叶片质膜H+-ATPase活性和氢泵活性也比YM叶片低,叶片气孔开度小于YM,从而使WM叶片蒸腾速率和气孔传导率均低于YM,使其耐旱性比YM强。用RT-PCR分析10%PEG胁迫下两种玉米叶片中5种不同亚型14-3-3基因和3种质膜H+-ATP酶基因（HA）转录水平的变化,结果说明WM叶片5种14-3-3基因和3种HA基因的本底转录水平都低于YM,PEG胁迫对YM和WM叶片5种14-3-3基因和3种HA基因的转录都有诱导作用,但在所有时间点WM叶片中5种14-3-3基因和3种HA基因的转录水平都低于YM,这也许是WM叶片质膜H+-ATPase活性低于YM叶片的一个重要分子机制。2.很多研究结果说明脯氨酸（Pro）、赤霉素（GA）和甜菜碱能增加植物的吸水能力和耐干旱性。本研究在10%PEG模拟干旱胁迫下分别添加Pro、GA和甜菜碱处理两种玉米,考察PEG干旱胁迫下添加Pro、GA和甜菜碱对叶片生理特性、14-3-3蛋白和质膜H+-ATP酶的互作及质膜H+-ATP酶活性的影响。结果说明与单独的PEG处理相比,在PEG胁迫下添加Pro、GA和甜菜碱不仅减少了两种玉米植株的失水率,而且也减少了两种玉米的气孔传导率和蒸腾速率,证实它们缓解PEG胁迫和叶片蒸腾作用的减少有关。在PEG胁迫下添加Pro、GA和甜菜碱使两种玉米叶片质膜H+-ATPase活性t H+-泵活性显著降低,叶片气孔开度显著减小,但是对两种玉米叶片中质膜H+-ATPase的磷酸化水平及其与14-3-3蛋白的结合有不同的影响效果：和单独的PEG处理相比,Pro的存在增强两种玉米叶片质膜H+-ATPase的磷酸化水平及其与14-3-3蛋白的结合；GA的存在减弱WM叶片叶片质膜H+-ATPase的磷酸化水平及其与14-3-3蛋白的结合,但却增强YM叶片质膜H+-ATPase的磷酸化水平及其与14-3-3蛋白的结合；甜菜碱的存在减弱两种玉米叶片质膜H+-ATPase的磷酸化水平及其与14-3-3蛋白的结合。这些结果说明在PEG模拟干旱胁迫下,Pro、GA和甜菜碱对质膜H+-ATPase磷酸化水平的影响可能不在直接与14-3-3蛋白结合的C末端,而是在和质膜H+-ATPase活性调控有关的其他结构域,对这些结构域的修饰作用间接调控质膜H+-ATPase和14-3-3蛋白的相互作用。3.腺苷-5’-单磷酸（AMP）和钒酸盐（VA）都是质膜H+-ATPase的抑制剂,前者能够抑制14-3-3蛋白与磷酸化质膜H+-ATPase的结合而降低质膜H+-ATPase的活性；而IAA和MgCl2是质膜H+-ATPase的激活剂,能够增强质膜H+-ATPase的磷酸化作用并促进14-3-3蛋白与磷酸化质膜H+-ATPase的结合,提高质膜H+-ATPase活性。上述研究结果表明在PEG干旱胁迫下,YM叶片的质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白的相互作用比WM的强,为了进一步考察在PEG模拟干旱胁迫下两种玉米叶片中质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白对气孔生理特性的调控作用,在10%的PEG模拟干旱胁迫下添加AMP和VA处理YM,结果发现与单独的PEG处理相比AMP和VA的存在显著降低YM植株的失水率,同时叶片蒸腾速率和气孔传导率均显著下降。COIP分析结果表明AMP显著降低质膜H+-ATPase磷酸化及其与14-3-3蛋白的结合,VA的存在也降低质膜H+-ATPase磷酸化及其与14-3-3蛋白的结合能力,二者的施用都显著降低质膜H+-ATPase酶的活性和H+-泵活性,气孔开度也明显减小,说明AMP和VA通过抑制质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白的相互作用来降低气孔开度和叶片的蒸腾作用,缓解PEG的干旱胁迫,在干旱胁迫下外源施用AMP和VA可显著增加玉米的耐旱能力。用IAA和MgCl2处理WM后,与单独的PEG处理相比,IAA和MgCl2存在使叶片蒸腾速率和气孔传导率显著增加,并显著增加植株的失水率。COIP分析结果表明质膜H+-ATPase磷酸化水平显著升高,与14-3-3蛋白的结合能力增强,酶活性和H+-泵活性显著上升,叶片气孔开度显著增大。这些结果说明说明PEG干旱胁迫下IAA和MgCl2的存在增加质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白的相互作用和气孔开度及叶片的蒸腾作用。这些结果证实在PEG模拟干旱胁迫下质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白对两种玉米叶片中气孔生理特性有重要的调控作用。用PEG处理盆栽WM玉米植株时添加VA也可以显著缓解玉米叶片干旱胁迫的症状,用PEG处理盆栽YM玉米植株时添加MgCl2则加剧玉米叶片干旱胁迫的症状。4.最近的研究表明H202能抑制质膜H+-ATPase的磷酸化及其与14-3-3蛋白的结合,从而降低H+-ATPase活性并减少离体蚕豆表皮条的气孔开度。抗坏血酸（ASA）是一种常用的H202清除剂,H202的产生依赖于脱落酸（ABA）,钨酸钠是ABA合成抑制剂,钨酸钠的存在也抑制H2O2的产生。在PEG干旱胁迫下YM叶片中H2O2的含量高于WM,为了解在PEG胁迫下H202是否参与两种玉米叶片质膜H+-ATPase活性的调控,在10%PEG干旱胁迫下添加ASA和钨酸钠处理YM,结果虽然使YM叶片蒸腾速率和气孔传导率分别上升,叶片H2O2的含量显著下降,植株失水率显著增加。COIP分析结果表明添加ASA和钨酸钠使YM叶片质膜H+-ATPase磷酸化水平显著升高,质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白的相互作用也显著增强,酶活性和H+-泵活性显著升高,气孔开度增大。这些结果说明说明ASA和钨酸钠的存在通过降低叶片H2O2的含量来增加质膜H+-ATPase的磷酸化水平,从而增强它与14-3-3蛋白的相互作用,使气孔开度及叶片的蒸腾作用增大,植株的失水率增加。在10%的PEG胁迫下添加H2O2处理WM,结果使WM植株失水率显著下降,叶片蒸腾速率和气孔传导率降低。COIP分析结果表明添加H202使WM叶片质膜H+-ATPase磷酸化水平显著下降,同时与14-3-3蛋白的结合也显著减弱,酶活性和H+-泵活性显著降低,气孔开度减小。这些结果证实在PEG胁迫下H2O2参与两种玉米叶片质膜H+-ATPase活性的调控,在干旱胁迫下外源施用H2O2显著提高玉米的耐旱能力。