【摘 要】
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2-酮基葡萄糖酸（2-ketogluconic acid,2KGA）是一种具有广泛用途的有机酸,目前主要作为合成食品抗氧化剂D-异抗坏血酸及其钠盐的前体。2KGA的工业生产通常采用发酵法,即利用假单胞菌（Pseudomonas）转化葡萄糖为2KGA的方法。高温胁迫下,假单胞菌的葡萄糖代谢由胞外氧化途径向胞内磷酸化途径偏转,从而导致发酵目的产物2KGA产量的明显降低。因此,假单胞菌耐高温菌株的选育在
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2-酮基葡萄糖酸（2-ketogluconic acid,2KGA）是一种具有广泛用途的有机酸,目前主要作为合成食品抗氧化剂D-异抗坏血酸及其钠盐的前体。2KGA的工业生产通常采用发酵法,即利用假单胞菌（Pseudomonas）转化葡萄糖为2KGA的方法。高温胁迫下,假单胞菌的葡萄糖代谢由胞外氧化途径向胞内磷酸化途径偏转,从而导致发酵目的产物2KGA产量的明显降低。因此,假单胞菌耐高温菌株的选育在理论和应用上均具有重要的研究价值。本论文以国内2KGA生产的主要工业用菌变形假单胞菌（P.plecoglossicida）JUIM01为出发菌株,首先采用紫外线、硫酸二乙酯（diethyl sulfate,DES）以及常压室温等离子体（atmospheric room temperature plasma,ARTP）诱变选育其耐高温突变株,然后利用适应性进化技术进一步提升突变株的高温耐受性,获得具有工业应用潜力的耐高温的2KGA高产菌株。在此基础上,通过比较亲株和进化菌株不同温度下2KGA合成与代谢相关基因转录水平的差异,初步探讨假单胞菌葡萄糖代谢对高温胁迫的响应规律。主要研究结论如下:（1）利用紫外线、DES和ARTP分别对变形假单胞菌JUIM01对数生长中期（14 h）的菌悬液进行诱变处理,然后利用碳酸钙溴甲酚绿筛选平板高通量筛选具有较高产酸水平的耐高温突变株,再利用高温发酵试验进一步筛选产酸水平高于亲株且遗传性状稳定的突变株,最终得到了3株耐高温的2KGA高产菌株,分别为紫外诱变突变株JUIM01-UV14、紫外硫酸二乙酯复合诱变突变株JUIM01-UD4和ARTP诱变突变株JUIM01-A25,其40℃下的发酵转化率分别为84.68%、84.70%和85.67%,相对于亲株分别提高了5.08%、5.11%和6.32%。（2）通过比较突变株JUIM01-UV14、JUIM01-UD4和JUIM01-A25高温耐受性及高温发酵产酸水平,选择JUIM01-A25作为适应性进化的出发菌株。根据不同温度下JUIM01-A25的生长过程,确定适应性进化过程中每12 h转接传代1次。在40℃的进化温度下,经过40代的适应性进化,获得了一株能够在40℃下正常生长的进化菌株JUIM01-T1。高温发酵试验结果表明:JUIM01-T1的最大细胞浓度(OD650nm)为9.56,而亲株JUIM01的最大细胞浓度仅为8.29;JUIM01-T1的发酵转化率为88.10%,相对于亲株提高了9.34%,基本接近亲株在32℃下的发酵转化率（89.70%）;JUIM01-T1的发酵生产强度为2.37 g/L·h,相对于亲株提高了16.88%,相对于亲株32℃下的生产强度提高了18.88%。（3）高温胁迫下,适应性进化菌株JUIM01-T1及其亲株胞外氧化途径（2KGA合成途径）相关酶的基因表达均会出现不同程度的下调,但JUIM01-T1的葡萄糖脱氢酶基因gcd、葡萄糖酸脱氢酶大亚基基因gnd L的表达量均高于亲株相应基因的表达量,预示JUIM01-T1具有相对更高的2KGA生物合成水平;高温胁迫下,葡萄糖磷酸化途径的葡萄糖激酶基因glk和6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf的表达上调,2KGA磷酸化途径（2KGA分解代谢途径）的2KGA转运蛋白基因kgu T、2KGA激酶基因kgu K、2-酮基-6-磷酸葡萄糖酸还原酶基因kgu D的表达下调,但JUIM01-T1的zwf表达水平高于亲株的zwf表达水平,且其2KGA磷酸化途径各基因的表达量明显低于亲株相应基因的表达量,说明JUIM01-T1的葡萄糖磷酸化途径相对于亲株更为活跃（有利于菌体生长）,2KGA分解代谢途径相对于亲株的活性更低（有利于2KGA的积累）;高温胁迫下,转录因子Hex R的基因表达下调,与葡萄糖磷酸化途径glk和zwf基因上调相对应;高温胁迫下,转录因子Ptx S的基因表达上调,与kgu操纵子中各结构基因表达下调相对应。
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