耐高温α-淀粉酶是目前最重要的工业酶制剂之一,广泛应用于发酵、制糖等工业。地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是国内生产高温α-淀粉酶的代表菌株之一。本文主要研究地衣芽孢杆菌B13高温α-淀粉酶(BLA)编码基因(amy)的克隆、序列分析及在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达。 用PCR方法从地衣芽孢杆菌B13的总DNA中扩增出一条约1.8kb的DNA片段,测序结果表明,该片段与B.licheniformis 584中的耐高温α-淀粉酶基因的同源性高达99％。将B.licheniformis B13耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中进行表达和表达产物活性测定,结果表明在大肠杆菌中,耐高温α-淀粉酶基因能利用自身的启动子及信号肽合成有活性的目标蛋白,并能分泌到胞外。 枯草芽孢杆菌是被广泛利用的来表达外源基因的良好宿主,但其本身包含有淀粉酶基因。利用无标记同源重组载体pDGIEF,敲除B.subtilis WB800的淀粉酶基因,构建了枯草芽孢杆菌WB800D,以此做为外源淀粉酶基因表达的良好宿主。利用穿梭载体pUBC19,将含有高温α-淀粉酶自身启动子序列和信号肽序列的amy基因与其进行体外重组,并转化B.subtilis WB800D,获得了表达菌株B.subtilis WB800D(pUBC19-amy)。但是,其表达量较低,活性不高。 利用穿梭载体pP43NMK,将含有信号肽序列的amy因片段与其进行体外重组,并转化B.subtilis WB800D,获得了表达菌株B.subtilis WB800D(pP43NMK-amy)。实验结果表明,在P43带动下,α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中得到了表达,与地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因自身启动子相比,采用P43启动子,α-淀粉酶表达水平提高了8.9倍。这项研究为构建高效表达耐高温α-淀粉酶基因工程菌奠定基础。