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腈水合酶(EC 4.2.1.84,nitrile hydratase,简称NHase)是一类可以催化腈类物质(带有-C≡N功能基团的化合物)通过水合反应转化为高附加值的酰胺类化合物的金属酶。其产物如丙烯酰胺、尼克酰胺等在饲料、化工、医药、造纸、树脂、纺织服装等领域具有广泛的应用。用腈水合酶生产酰胺类化学品具有成本低,能耗低,污染少的优点。在发达国家,该技术正逐步取代传统的化学方法。因此,拓展腈水合酶的应用特性,使其更加符合其在不同领域的应用的要求,对我国具有很大的经济价值和可持续发展意义。本课题对重组恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida NRRL-18668)腈水合酶进行了蛋白质工程改造。改造围绕提高腈水合酶稳定性与新型分离纯化工艺的开发这两点展开。主要研究结果如下:(1)采用同源蛋白质片段交换重组的方法,尝试提高来源于P.putida NRRL-18668的腈水合酶(Pp NHase)的稳定性。研究以嗜热假诺卡菌Pseudonocardia thermophila JCM3095(Pt NHase)腈水合酶的C端结构和睾丸酮丛毛单胞菌Comamonas testosterone5-MGAM-4D腈水合酶(Ct NHase)的N端结构作为模板,利用位点靶向氨基酸重组(STAR)软件和分子动力学模拟分析选择了合适的同源靶片段与重组位点,通过同源片段交换了Pp NHase相应的片段,构建了7株分别含有三种不同来源的新型杂合腈水合酶(1A、2B、2C、2BC、3AB、3AC、3ABC)。经过50°C热处理10 min后残存酶活力与野生型腈水合酶相比,热稳定性分别提高至1.5-3.5倍。其中6株杂合腈水合酶的产物耐受性得到提高,两株杂合腈水合酶3AB和3ABC相对于野生型Pp NHase酶活分别提高至1.4和1.1倍。(2)进一步研究还发现杂合酶3AB的热稳定性相对于野生酶Pp NHase提高至3.2倍、酶活力提高至1.4倍、产物耐受性提高至1.5倍、Tm值增加4°C、更耐酸性(低p H)。圆二色光谱分析(Circular Dichroism,CD)以及蛋白质同源建模(Homology modeling)分析分别表明,野生型Pp NHase相比,3AB在二级、三级结构上与发生了微小改变。酶动力学结果显示,3AB的Km比野生型Pp NHase显著降低,分子改造提高了3AB的催化效率。(3)此外,本研究探索了基于可逆相变循环(ITC,inverse transition cycling)的快速、简便、廉价的新型蛋白质纯化方法。实验设计了两种类型的类弹性蛋白(ELP)标签,设计了两种NHase-ELP重组酶(NHase-[V5A2G3]-20和NHase-[V]-20)。采用优化后的ITC方法实现了两种重组酶的高效纯化,NHase-[V5A2G3]-20和NHase-[V]-20的纯化倍数分别为11.1倍和1.9倍。同时两种ELP-NHase相比于野生型NHase表现出了较好的温度稳定性。