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伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的以瘙痒、神经症状等为特征的疾病,疫苗接种是预防该病的有效方法。自2011年下半年以来,我国黑龙江省、河南省、吉林省等多省份的按正常免疫程序免疫PRV Bartha-K61疫苗的规模化猪场仍爆发PR,造成母猪流产,产弱仔、死胎,给养猪业造成了巨大损失。为了进一步了解PRV的流行情况及生物学特性,本研究已分离出了多株PRV变异株,并对其gE基因序列进行测定及分析,同时对其抗原差异性和现有疫苗保护效果进行评价。1.PRV变异株的分离鉴定2012年以来,本研究将从河南、吉林、黑龙江、山东等十多个省份的的已免疫过Bartha-K61疫苗的规模化猪场疑似PR发病猪的鉴定为gE阳性的脑组织匀浆中分离出了多株PRV,分别命名为PRV-JL1及PRV-HU1等。将病毒接种Vero细胞均可出现网格状细胞病变。电镜下可以观察到病毒粒子呈球形,有的有囊膜有的没有囊膜,呈中空和实心两种特征。将PRV-JL1等近三年来本实验室分离鉴定的及GenBank中登录的来源于河南省、黑龙江省、内蒙古等10多个省份的33个PRV毒株同PRV双城株(PRV-S)及GenBank中登录的21个经典PRV毒株的gE氨基酸序列进行比对分析表明：近三年分离的毒株与本实验室之前分离的变异株PRV-HeN1的同源性在97.1%-99.5%之间,而和经典株PRV-S的同源性在96.6%～99.1%之间,而且gE氨基酸系统进化树结果显示近三年分离的毒株形成了一个相对独立的分支,与经典株亲缘关系相对较远。以上结果表明PRV变异株已成为我国主要流行的毒株,而且变异株之间具有相同的分子特征,即在gE氨基酸第48位和第492位各有1个天冬氨酸的插入。2.PRV变异株的抗原差异性分析及疫苗保护效果评价选取10头40日龄的SPF仔猪,其中5头肌注1mL含107.0TCIDs0的变异株PRV-HeN1(2012年分离于河南省),5头肌注1mL107.0TCID50的经典疫苗株Bartha-k61,每周采血分离血清。然后用制得的血清与变异株和经典株进行交叉中和试验,结果显示免疫变异株(PRV-HeN1)的血清对自身及经典株(Bartha-K61和PRV-S株)中和效价较高(1:80-1:320),而免疫经典株(Bartha-K61)的血清对自身及变异株(PRV-HeN1)的中和效价较低(1:10-1:32)。选取14只PRV抗原抗体阴性的6月龄的绵羊,随机分为两组,一组7只。两组均用Bartha-K61疫苗免疫4只(0.2头份／只),其余3只不免作为对照；14天后,连同对照组一组攻击变异株PRV-HeN1,一组攻击经典强毒株PRV1S,剂量均为1000LD50(LD50是以小鼠为模型测定的)：观察绵羊发病、死亡情况。试验结果显示：攻PRV-HeN1组对照全部死亡,实验组2只死亡2只存活,保护率仅为50%；攻PRV-S组对照全部死亡,实验组全部存活,保护率为100%。以上结果表明现有PRV疫苗的免疫原性并未发生变化,对经典强毒(PRV-S)仍能提供完全保护,而对变异株(PRV-HeN1)却不能提供完全有效的保护。我们对58份绵羊血清分别用ELISA和中和试验两种方法进行检测,比较它们之间的相关性。结果表明ELISA检测为阳性的33份血清用中和试验方法检测共有31份为阳性,二者的一致率为94%;ELISA方法检测为阴性的25份血清用中和试验检测也全为阴性,二者的一致率为100%。因此我们认为可以用ELISA代替传统的中和试验方法来检测PRV抗体筛选PRV抗体阴性绵羊。