1.背景与目的:随着人们生活水平的提高,冠心病的发病逐年增多,已成为威胁人类健康的主要疾病。药物治疗、经皮冠状动脉介入(PCI)治疗和外科冠脉旁路移植手术即冠状动脉“搭桥”(CABG)是治疗冠心病的三种手段和方法,但临床上尚有很大一部分病例疗效尚不理想。血管再生治疗是目前研究的一大热点,为缺血性心脏病尤其是那些不适合于PCI、CABG及内科药物治疗或效果极差的病人开辟了新的治疗途径。组织损伤后伤口及其附近上皮存在的损伤电流场源是一种稳恒直流电场,具有促使损伤愈合等生物学效应。内源性电场不仅可使组织细胞分裂、增殖、向伤口定向迁移、重塑,而且可刺激血管细胞向伤口趋电迁移,损伤组织出现血管“发芽”再生。而血管新生、组织得以血液灌注是损伤愈合的关键。组织缺血性损伤后往往血管再生不足,能使血管“发芽”再生有明显效果的电场强度为150-400 mV/mm,而缺血心肌细胞自发损伤电场为5.8mV /mm,如此弱的电场是不可能对血管生成有影响的。因而通过电刺激来促进血管新生及侧支循环的形成可能翻开治疗缺血性损伤的新篇章。动物实验表明,于大鼠缺血肢体的缺血和非缺血位置施加低压稳恒直流电场,能使肌肉和内皮细胞VEGF表达产量明显增加,进而大量新生血管形成,肢体缺血得以明显改善。此外,外加稳恒直流电场已广泛地成功治疗各种皮肤及非皮肤损伤。研究表明,机体自身产生的生物电场不足以促进损伤愈合的进程时(如患有糖尿病,缺血性疾病),在损伤区和未损伤区之间施加外加电场能明显增强损伤愈合速率。然而,外加稳恒直流电场也是否如同作用于皮肤和肢体等组织损伤一样,于缺血(梗死)心肌的缺血和非缺血区域施加适宜的稳恒直流电场是否也促进大量血管新生及侧支循环形成?也可促进缺血(梗死)损伤心肌的修复和再生?缺血心肌血供、心室重塑及心功能是否得以改善?电流通过组织时会产生电热、电化学及电生理等也可能对组织有害的反应,对上述150-400mV/mm稳恒直流电场直接作用于心脏的安全性评估,目前研究尚少。本课题以家兔心脏为研究基本模型,旨在将稳恒直流电场用于心肌缺血(梗死)治疗,对其安全性和有效性进行初步探索。2.方法第一部分初步探索外加稳恒直流电场直接作用于心脏的安全范围。(1)将WYJ系列高精度直流稳压稳流电源等制作成稳恒直流电场发生装置,将含量99%铂(Pt)条制成1对极身1.0cm长Pt电极。(2)探讨低压稳恒直流电场对组织间液的电化学作用。中国家兔10只,经心脏直接采取已肝素化动脉血代替组织间液加入希托夫管中施以4.5V或6.0V稳恒直流电电解1 h。留取正常血液及电解完毕后阴极管、阳极管和中间管血液,分别测定其pH值及HCO3?、K+、Na+、Cl?、Ca2+等离子浓度。(3)探讨正常家兔心脏受低压稳恒直流电场直接作用对心电活动及血流动力学的影响。家兔开胸后直接在心外膜上,以冠状动脉左室支的主支下段为中线平行安放一对Pt电极,施与0~6V /cm稳恒直流电场,监测体表肢导联ECG、有创监测股动脉血压和左心室内压,测量、分析ECG和血流动力学参数。(4)探讨低压稳恒直流电场直接作用于正常家兔心脏对心脏的电损伤。上述实验过程中同时监测正电极处心外膜表面温度,光镜和电镜观察心肌组织学变化。第二部分在家兔模型梗死心肌局部施加平面和透壁两种作用方式、2.0V和3.0V两种强度的稳恒直流电场,探索其促进缺血(梗死)心肌修复的有效性。(1)在非人工通气的情况下建立心肌缺血(梗死)实验动物模型。10只开胸行心脏冠状动脉左室支结扎作为冠脉结扎组,5只开胸后不结扎冠脉作为假手术组。4周后处死,观测其心电图、血流动力学等参数和心脏组织学特征。(2)外加低压稳恒直流电场促进兔梗死心肌修复效应的实验研究。健康中国家兔40只均予冠脉结扎。随机分配为以下5组,①心肌梗死(MI)组;②平面电场2V(PEF2V)组;③平面电场3V(PEF3V)组;④透壁电场2V(TEF2V)组;⑤透壁电场3V( TEF3V)组。分别给与相应类型和剂量的直流电场干预。4周后去甲肾上腺素激发实验分析心功能;处死动物后,测量心系数,肺系数,肝系数,肺脏湿重与干重比率,肝脏湿重与干重比率;对梗死部位心肌组织进行Masson染色,评估心肌梗死面积;评估心肌纤维化程度;免疫组织化学染色和Western Blot测定Ⅰ型胶原纤维/Ⅲ型胶原纤维的蛋白表达;CD31免疫组织化学染色检测毛细血管密度。(3)外加低压稳恒直流电场在促进兔心肌梗死模型损伤修复中的心肌细胞增殖和凋亡效应。继续观察上述心肌组织,Ki-67核抗原标记检测心肌细胞增殖;TUNEL法检测心肌细胞凋亡;免疫组织化学染色和Western Blot测定心肌细胞凋亡基因相关蛋白Bcl-2/Bax的表达。3.结果(1)改进的WYJ直流稳压稳流电源其电压在0~.5V均精细可调;自制的铂电极在电场5V/cm时电极板处电流密度最高仅为0.089 mA/cm2,且作用1h后心肌组织均无肉眼可见的组织电灼伤。(2) 6.0V以下稳恒直流电场对组织间液的电化学作用对组织的损害可以忽略不计;场强≤3.0 V/cm对ECG参数和血流动力学的影响均在安全范围;场强≤3.5V/cm)不会出现电击和组织学损伤。(3)与冠脉假结扎组比较,冠脉结扎组其ECG和组织学特征均表现为心肌梗死;4周后去甲肾上腺素激发实验心功能分析,评定心脏收缩功能的指标LVSP、+dp/dtmax和t-+dp/dtmax,冠脉结扎组降低和缩短,而冠脉结扎组评定心脏舒张功能的指标LVEDP升高、而-dp/dtmax降低。(4)心肌梗死组与各电场干预组间心、肺、肝等有关参数无统计学差异;去甲肾上腺素心功能激发实验表明,PEF2V、TEF2V和TEF3V治疗可改善心肌梗死后的收缩及舒张功能;在梗死面积的缩小及梗死区边缘带纤维化程度降低方面,透壁电场优于平面电场;两透壁电场还有利于ECM中胶原的重塑;TEF3V不仅可明显促进非梗死区毛细血管的形成,而且也可促进梗死区边缘带和梗死区毛细血管的形成,尤以非梗死区明显。(5)电场干预后在非梗死区,PEF2V及TEF3V均能明显促进心肌细胞增殖;在梗死区边缘带,各电场干预组均表现明显的心肌细胞增殖,两透壁电场作用均优越于两平面电场;与心肌梗死组对照相比,仅在梗死区边缘带PEF2V及TEF3V对心肌细胞凋亡有明显抑制;心肌细胞中凋亡基因相关蛋白Bcl-2和Bax主要在非梗死区和梗死区边缘带表达,以边缘带区为主。且在非梗死区和梗死区边缘带,Bcl-2的表达在各组间表现为逐步增加的趋势;透壁电场组作用均强于平面电场组。而Bax的表达正好与之相反。4.结论(1)改进的WYJ直流稳压稳流电源以及自制的铂电极完全能满足本课题研究的需要;场强≤3.0 V/cm的外加稳恒直流电场对家兔心电活动、血流动力学、组织间液的电化学作用、组织学电损伤等无明显影响,因而是安全的。(2)根据兔心在胸腔的解剖学位置特征,在非人工通气的情况下建立的心肌缺血(梗死)模型的制作方法,有效、简便和实用,为电场干预实验提供了基础平台。(3)在兔模型梗死心肌局部施加平面和透壁两种作用方式、2.0V和3.0V/cm两种强度的稳恒直流电场。结果显示:①适宜的低压稳恒直流电场促进了血管新生和侧支循环形成,缩小了梗死面积,降低了心肌纤维化程度,减轻了左心室病理的重塑,改善了左心室功能,对慢性缺血和心肌梗死模型的心肌起到了保护作用。②适宜的外加稳恒直流电场可促进心肌梗死后心肌细胞增殖,抑制心肌细胞的凋亡,这可能有利于梗死后心脏的再生与功能修复。③总体上,透壁电场作用方式,尤以透壁电场3V时比平面电场效果优越。(4)本研究由于是家兔模型,心脏太小,其解剖和冠脉侧支血流存在一定程度变异,因而本研究仍然是初步探索性的。需要进一步在大动物尤其是猪、狗模型研究平台上对很多非处理因素标准化后进行评价,使实验状况更具普遍意义和贴近临床。