气孔是植物与环境间进行水分和气体交换的门户,是由一对保卫细胞围绕而成的。干旱下,气孔的暂时关闭有利于植物减少水分蒸腾保持体内有限水分。气孔的关闭主要受保卫细胞的膨压影响。随着对保卫细胞研究的深入,提取保卫细胞原生质体几乎成为一种必需的手段。蚕豆因其生长周期短、叶片柔软易于撕取下表皮而成为研究保卫细胞的一种模式材料。本实验以蚕豆叶片为材料,将直接撕取表皮和从水中撕取表皮这两种方法从撕取的难易程度、表皮的伸展度、酶解过程、酶解的效果、酶解时间等方面进行了比较,确立了蚕豆叶片保卫细胞原生质体的提取方法:第一,从水中直接撕取叶片下表皮,得出从水中撕取表皮的方法远远优于直接撕取表皮法。而其他类似于蚕豆叶片这种柔软度的叶片在撕取表皮时,这种方法同样适用;第二,将撕取的下表皮在含有0.7% cellulysin的第一酶解液中酶解约45min,再将其转入含有1%纤维素酶RS、0.01%果胶酶的第二酶解液中酶解大约40min,过滤取滤液。第三,将滤液在200g下离心6min,共两次。再用密度梯度离心法于200g下离心13min,吸取中间层,于200g下离心6 min洗涤,即得到较为纯净的保卫细胞原生质体。在原生质体分离纯化方面将密度梯度离心与传统的低速离心相结合,尽管步骤增加,却大大降低了其中杂质的含量,获得了更为纯净的原生质体,为后续进一步研究保卫细胞原生质体打下良好的基础。cDNA文库是扩增未知基因的一种有效方法,为扩增和蚕豆叶片保卫细胞相关的基因,构建了蚕豆叶片cDNA文库。首先以蚕豆叶片为材料,利用天根公司的TRNzol–A+总RNA提取试剂提取蚕豆叶片的总RNA,电泳和比色结果表明所提取的总RNA具有较高的完整性和纯度。随后采用SMART cDNA合成技术合成cDNA第一链,经LD-PCR合成双链cDNA、蛋白酶K消化、SfiI酶切、CHROMA SPIN-400柱层析分级分离获得蚕豆叶片的cDNA,与PDNR-LIB载体连接,电转化进宿主菌DH5α,得到了蚕豆叶片cDNA的原始文库,滴度计算表明该文库达到后续试验要求。