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第一部分 神经元缺血/再灌注损伤后基因表达谱变化的研究目的:新生儿缺氧缺血性脑病（Hypoxic Ischemic Encephalopathy,HIE）涉及缺氧缺血和随后的再灌注过程,可导致不可逆的脑损伤。然而,其潜在的病理机制仍在探索中。为了全面、实时地观察HIE发病过程中涉及的细胞自主机制,我们采用二代测序（Next-Generation Sequencing,NGS）技术来阐述在糖氧剥夺/再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R）条件下,模拟缺血/再灌注,观察原代培养的海马神经元基因表达谱随时间的表达变化,并寻找关键基因,以探究HIE后基因层面的相关机制。方法:1、培养原代大鼠海马神经元,建立体外缺氧缺血细胞模型-糖氧剥夺/再灌注模型（OGD/R）。2、对各组神经元（对照组（OGD 0分钟/R 0小时）、糖氧剥夺45分钟（OGD 45分钟/R 0小时）、糖氧剥夺45分钟后再灌注6、12小时及18小时（OGD 45分钟/R 6小时,OGD 45分钟/R 12小时,和OGD 45分钟/R 18小时））进行RNA-Seq。3、对以上各组神经元差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）进行生物信息学分析,包括基因本体（Gene Ontology,GO）分析,京都基因和基因组学百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics,KEGG）通路（pathway）分析,基因互作网络和基因共表达分析,筛选涉及OGD/R病理变化的新的关键基因和通路。4、对筛选的关键基因行qRT-PCR验证。5、制备大鼠缺血/再灌注模型即大脑中动脉闭塞/再灌注（Middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R）模型,并对模型制备成功与否行TTC验证。6、通过qRT-PCR、Western blot检测选取的关键基因Itga5、ErbB4在MACO/R大鼠脑内的表达变化。7、对培养的神经元转染siRNA敲低Itga5的表达,qRT-PCR、Western blot检测siRNA敲低Itga5的效果。8、MTT法检测siRNA转染神经元的活力,TUNEL法检测siRNA转染神经元凋亡的情况。结果:1、OGD/R各组神经元经RNA-Seq后,用RPKM法计算各样品的基因表达水平,比较各组之间（OGD 45分钟/R 0小时vs OGD 0分钟/R 0 h、OGD 45分钟/R 6小时vs OGD 45分钟/R 0小时、OGD 45 分钟/R 12 小时 vs OGD 45 分钟/R 0 h、OGD 45 min/R h 18h vs OGD 45min/R 0 h）的基因表达谱,组组之间均有较大差异（FDR≤0.001且倍数变化>2）。2、差异表达基因（DEGs）的功能富集分析表明,GO分析显示,OGD诱导强应激和凋亡反应,KEGG分析进一步显示TNF信号传导通路和Toll样受体信号传导通路均参与刺激后的炎症反应;激活的MAPK通路在OGD初始阶段显著富集,在再灌注后期逐渐消失。3、通过构建共表达网络,不同OGD/R组别中的关键基因被筛选出来,这些基因的qRT-PCR结果与生物信息学分析结果一致。4、大鼠MCAO模型制备成功,qRT-PCR、Western blot结果表明,选取的通过神经元OGD/R模型筛选出来的Itga5、ErbB4两基因在MCAO/R大鼠不同时间点脑组织内的表达有显著变化。5、MTT及TUNEL结果显示,通过siRNA阻断培养的神经元内Itga5,能明显抑制OGD后神经元的凋亡。结论:本研究利用RNA-seq技术对神经元OGD/R模型进行测序,筛选出了大量差异表达基因;同时通过生物信息学分析,对这些差异表达基因进行了功能富集,对涉及到的生物学过程及信号通路有了新的认识;另一方面共表达网络筛选出了新的关键基因,其中关键基因Itga5、ErbB4经验证在体内MACO/R模型中同样有着显著的表达变化,说明体外神经元OGD/R模型能够模拟脑缺血/再灌注的病理学过程;关键基因Itga5表达的上调促进了神经元的凋亡。第二部分 神经元缺血/再灌注损伤后lncRNATnxa-ps1的表达变化目的:缺血/再灌注后神经元转录组可发生广泛变化。研究大都集中在与缺血再灌注脑损伤相关的mRNA的转录组变化上,该过程中是否涉及在细胞稳态中起关键作用的长链非编码RNA（long non-coding RNAs,lncRNAs）以及lncRNAs表达变化持续多长时间知之甚少。在本研究中,我们通过高通量筛选,分别在糖氧剥夺/再灌注（OGD/R）0h,6h,12h和18h条件下,分析了原代培养的海马神经元中lncRNAs的表达变化,以及与mRNAs之间的联系,并找出相关lncRNA对神经元凋亡的影响。方法:1、原代培养大鼠海马神经元,建立体外缺氧缺血细胞模型-糖氧剥夺/再灌注模型（OGD/R）。2、对各组神经元（对照组（OGD 0分钟/R 0小时）、糖氧剥夺45分钟（OGD 45分钟/R 0小时）、糖氧剥夺45分钟后再灌注6、12小时及18小时（OGD 45分钟/R 6小时,OGD 45分钟/R 12小时,和OGD 45分钟/R 18小时））进行RNA-Seq。3、筛选出差异表达的lncRNAs并对其中部分lncRNAs行qRT-PCR验证。4、构建siRNA转染神经元,敲低lncRNATnxa-ps1的表达,MTT法检测相应转染神经元的活力,TUNEL法检测相应转染神经元凋亡的情况。5、结合第一部分数据进行编码非编码共表达网络分析,寻找与Tnxa-ps1相关的mRNAs,并对其中部分mRNAs行qRT-PCR验证。6、siRNA 转染神经元,敲低 lncRNA Tnxa-ps1 的表达,qRT-PCR 检测 Vip,Chga,nefm 和Nefl等代表性mRNAs的表达变化。7.通过生物信息学软件 RegRNA2.0（http://regma2.mbc.nctu.edu.tw/）预测与 Tnxa-ps1 结合的靶标 miRNA;通过 Targetscan 数据库（http://www.targetscan.org/vert72/）,进行 itga5 mRNA 3’UTR区的miRNA结合位点预测。结果:1、OGD/R各组神经元经RNA-Seq后,不同组别通过比较筛选出差异表达的lncRNAs。2、Tnxa-ps1表达被抑制时,细胞活力得到增强,神经元凋亡数量得以降低。3、编码非编码共表达网络分析及qRT-PCR验证表明,Tnxa-ps1与一些mRNAs的表达相关联。4、抑制Tnxa-ps1能逆转OGD/R后所选mRNAs表达的变化,包括Vip,Chga,nefm和Nefl等。5.生物信息分析发现Tnxa-ps1有13条潜在的miRNA,分别是rno-miR-326,rno-miR-329,rno-miR-330,rno-miR-298,rno-miR-224,rno-miR-483,rno-miR-423,rno-miR-484,rno-miR-667,rno-miR-3541,rno-miR-3547,rno-miR-1188-5p 和rno-miR-702-5p;Itga5 mRNA 3’UTR 区存在 2 个rno-miR-484 结合位点,分别位于 ITGA5 3’ UTR 427-434 和 780-786 处。结论:本研究利用RNA-seq技术对神经元OGD/R模型进行测序,筛选出了差异表达的lncRNAs;敲低lncRNATnxa-ps1能通过抑制细胞凋亡而促进神经元存活;Tnxa-ps1的表达与特定基因组的变化高度相关;Tnxa-ps1的下调逆转了 OGD/R后4种mRNA的表达变化,揭示了 Tnxa-ps1对所选基因具有调节作用;Tnxa-ps1还可能通过竞争性内源性机制与Itga5 mRNA竞争性结合rno-miR-484,从而在转录后水平调控Itga5蛋白编码基因的表达,参与了 OGD/R神经元的凋亡。总之,我们的数据揭示了 lncRNAs可能参与缺血/再灌注的病理生理学过程。