【摘 要】
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猫麻疹病毒(feline morbillivirus,Fe MV)是在2016年国际病毒分类委员会上命名的第7种麻疹病毒属(paramyxoviridae)病毒。麻疹病毒属的绝大部分成员是人类和动物的重要病原体,具有很强的致病性,可能会引发动物和人类的死亡。自2012年Fe MV首次在香港报道以来,已经在世界上多个国家和地区检测到。到目前为止,中国大陆还没有对Fe MV检测的报道。为了研究Fe M
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猫麻疹病毒(feline morbillivirus,Fe MV)是在2016年国际病毒分类委员会上命名的第7种麻疹病毒属(paramyxoviridae)病毒。麻疹病毒属的绝大部分成员是人类和动物的重要病原体,具有很强的致病性,可能会引发动物和人类的死亡。自2012年Fe MV首次在香港报道以来,已经在世界上多个国家和地区检测到。到目前为止,中国大陆还没有对Fe MV检测的报道。为了研究Fe MV的流行情况,本研究自2017年~2018年在广东省广州市共收集到64份猫尿样品,通过巢式PCR对病毒较为保守的L基因进行特异性扩增,其中有6份猫尿样品检测为Fe MV阳性,阳性样品的比例为9.4%。将这6株Fe MV分别命名为GD1,GD2,GD3,GD4,GD5和GD6。根据测序结果并基于Fe MV的L基因遗传分析显示,这6株病毒与2012年在香港报道的776U和761U在同一个分支中。从阳性猫尿样品中提取病毒RNA,通过RT-PCR的方法扩增得到N基因,将其克隆到p MAL-c5X中构建原核表达质粒p MAL-c5X-N,将测序正确的质粒转化表达菌株Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达与纯化获得重组N蛋白,用Western-blot方法分析N蛋白的抗原特性;将纯化后的重组N蛋白作为抗原,通过混合水溶性佐剂Gel 01ST后多次免疫新西兰大白兔后获得抗Fe MV N蛋白多克隆抗体,经间接ELISA检测,获得的抗Fe MV N蛋白多克隆抗体效价超过1:1000000,为后续Fe MV的N蛋白细胞亚定位研究提供材料。在副黏病毒复制期间,N蛋白可能在细胞质与细胞核中穿梭,N蛋白的核转运可能在麻疹病毒的致病性中起重要作用。根据麻疹病毒现有的研究,预测出Fe MV N蛋白核输出信号位于N蛋白N端前20个氨基酸。为了确定Fe MV核输出信号的具体氨基酸序列,本研究将N蛋白N端前20个氨基酸首尾逐一截短10个氨基酸,将其对应的核苷酸序列与p EGFP-C3真核表达系统构建20个真核表达质粒,通过转染293T人肾上皮细胞,观察表达出的绿色荧光蛋白在细胞中的亚定位情况。通过分析确定Fe MV N蛋白核输出信号位于3~11位点的氨基酸,并通过克隆3~11位点氨基酸对应的核苷酸序列与p EGFP-C3构建真核表达质粒来验证其核输出能力。本研究确定了Fe MV N蛋白核输出信号氨基酸位点,为Fe MV N蛋白的转运穿梭机制及病毒的致病性的研究奠定基础。
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