大米蛋白/乳清蛋白纳米颗粒的构筑机制及功能物包载研究

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大米蛋白(RPs)是一种来源丰富、营养均衡的植物蛋白质资源。但较高的谷蛋白含量(>80%)导致其溶解度低下,商品化程度不高。常规的RPs改性过程复杂,且改性效率有待进一步提高,未从根本上解决RPs的商品化难题。本研究从阻碍RPs质子化过程的抗折叠动态过程入手,利用pH循环法构建了乳清蛋白(WPIs)-RPs复合物体系(WRPs),并分析了其形成机理;探索了 WRPs和丁香酚的自组装行为,并对其微观形态进行表征;从热力学、界面学和结构学解析自组装形成机制;以紫杉醇(PTX)为功能物模型,以自组装为媒介,构建了载体化功能物(PTX@WRPs),并利用体外实验和体内实验研究了 PTX@WRPs的生物活性。本研究旨在为复合蛋白质体系在食品、医药等行业的应用提供理论指导和实践依据。具体研究内容如下:首先,利用RPs和WPIs在碱性条件下去质子化,继而缓慢中和至pH 7.0,离心、透析、冻干得到WRPs。相比于RPs,WRPs中RPs的溶解度提高了 25倍以上,最高可达54.08%。形态表征表明,WRPs为粒度范围100 nm左右的纳米颗粒,且完整地保留了两种蛋白的一级结构。分子学研究表明,WPIs与RPs在质子化过程中发生融合,削弱了各自蛋白的折叠趋势,从而形成一种新的协同结构;静电力、氢键和疏水作用是引起上述现象的主要原因。同时,较高的表面电势(-32 mV)稳定了可溶性WRPs。此外,WRPs具有比RPs和WPIs更均衡的氨基酸组成,因而具备更高的营养价值。其次,基于WRPs与丁香酚特有的自组装特性,研究了 WRPs-丁香酚自组装颗粒(WRPs SNs)的结构特性及性能表现。WRPs的水溶液和丁香酚在低速搅拌条件下,可形成粒径范围为140.6~165.8 nm的自组装颗粒。当WRPs与丁香酚质量体积比为1:3时,WRPs SNs的多分散性最好(PDI<0.2),丁香酚装载量可达395.71 μg/mg蛋白。由形状因子(Rg/Rh)可知,WRPs SNs为类球形,且中心密度大于边缘(Rg/Rh<0.775)。WRPs中较多的疏水性残基使WRPs具有更好的界面活性,从而大大降低了油-水界面张力,降幅达89.50%。结构表征表明,共价键未参与自组装过程,且蛋白质的二级结构在自组装前后无明显变化,但疏水性氨基酸残基溶液微环境变化较大。因而推断自组装是一个由疏水作用主导、熵增的自发反应过程。最后,以自组装体为媒介成功的制备了载体化紫杉醇(PTX)PTX@WRPs,其中PTX含量为27.13 mg/g蛋白。细胞实验表明,WRPs空载在细胞表面富集并在内吞作用下进入细胞。WRPs载体能显著降低PTX 48 h对HepG-2细胞半数致死量(IC50),从0.264μg/mL下降到了 0.012 μg/mL。动物实验表明,WRPs载体对肿瘤细胞没有明显抑制作用。相比于游离PTX组,PTX@WRPs组的肿瘤体积下降了 30.70%,抑瘤率达到了 59.12%;对照组和WRPs组的肝部肿瘤转移明显,PTX@WRPs仅出现了少量的肿瘤转移现象。PTX@WRPs对小鼠脏器关键指标的影响显著低于游离PTX组。上述结果表明,WRPs纳米颗粒的构筑能有效地提升RPs的溶解度,加快RPs产品商品化进程。同时鉴于WRPs与丁香酚的自组装特性,本研究将有助于进一步开拓功能物载体领域,为生物工程和医药等行业提供更多可供选择的天然的载体材料。
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