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呋喃唑酮(Furazolidone, FZD)是人工合成的硝基呋喃类抗菌药,具有良好的抗原生动物和细菌感染作用。曾广泛用于动物促生长饲料添加剂,随着对其毒性的深入研究,发现其在多种动物体内体外表现出遗传毒性和潜在致癌性,但其毒性机理尚未完全阐明。本实验室前期研究显示呋喃唑酮攻毒人肝癌HepG2细胞后,细胞发生增殖抑制并且阻滞于S期,同时引起DNA链及碱基氧化损伤,证实了JNK与p38MAPK通路参与调控呋喃唑酮引起S期阻滞。但在呋喃唑酮对HepG2细胞毒性作用中凋亡是否发生尚不清楚。因此,本研究在HepG2细胞为模型的基础上,研究呋喃唑酮对HepG2细胞凋亡的作用,以及PI3K/Akt通路和p21w2f1/ciP1(p21)在此过程中的可能调节机制。从而为进一步揭示呋喃唑酮分子毒性机制提供依据。本研究以0,12.5,25,50μg/ml浓度的呋喃唑酮处理HepG2细胞24h后,采用MTT, Hoechst/PI染色和流式细胞术检测了呋喃唑酮对细胞增殖率、细胞凋亡形态学及凋亡率的影响。结果表明呋喃唑酮引起HepG2细胞增殖抑制并且发生典型的凋亡形态学改变,凋亡率呈剂量依赖性增加。应用荧光探针DCFH-DA和罗丹明123流式检测呋喃唑酮处理后的HepG2细胞内ROS生成和线粒体膜电位的改变,结果表明胞内ROS急剧升高,线粒体膜电位降低,具有剂量依赖性。在对线粒体凋亡途径上的caspase-9和caspase-3酶活性及相关基因mRNA和蛋白表达检测发现,呋喃唑酮呈剂量依赖性的引起caspase酶活性升高,同时caspase-9、caspase-3、Bax, Cyt c mRNA水平升高,而Bcl-2的mRNA水平降低。Western blot结果显示呋喃唑酮导致PARP蛋白剪切,caspase-9、 caspase-3前体减少,Bax/Bcl-2比值升高,Cyt c从线粒体释放到胞质中。caspase广谱抑制剂及caspase-9和caspase-3特异性抑制剂能够阻断呋喃唑酮诱导的凋亡。抗氧化剂NAC抑制了呋喃唑酮诱导的ROS升高,使线粒体膜电位恢复,凋亡相关蛋白和caspase酶活性发生相应变化从而抑伟HepG2细胞凋亡。以上结果表明,呋喃唑酮诱导HepG2细胞发生凋亡可能是依赖ROS及caspase的线粒体凋亡途径所介导的。为了探讨PI3K/Akt信号通路在呋喃唑酮所致的细胞凋亡中的作用,本研究首先检测了呋喃唑酮对Akt的mRNA,蛋白表达及磷酸化的影响。然后采用PI3K/Akt通路激动剂IGF-1和抑制剂LY294002分别激活或抑制该通路后,检测染毒后细胞增殖及凋亡、胞内ROS水平、线粒体膜电位、caspase酶活性以及凋亡相关蛋白表达的变化。结果表明,呋喃唑酮下调了Akt mRNA水平,同时抑制了总Akt蛋白的表达和其磷酸化。NAC使p-Akt;水平有所恢复,但对总Akt蛋白无影响。50ng/ml的IGF-1和20μM LY294002能够有效的增强或抑制Akt蛋白磷酸化。激活PI3K/Akt通路后,明显抑制了呋喃唑酮诱导的凋亡。而抑制该通路后,凋亡加剧。PI3K/Akt通路的激活与否对呋喃唑酮引起的ROS升高无显著影响,线粒体膜电位、凋亡相关蛋白表达和酶活性结果显示,激活该通路后,抑制了呋喃唑酮导致的caspase-9、caspase-3活化,PARP剪切以及Cyt c释放。同时使膜电位恢复和Bax/Bcl-2比值下降。而抑制PI3K/Akt通路后,呈现相反趋势。以上结果表明,PI3K/Akt通路参与了呋喃唑酮引起的线粒体功能损伤和细胞凋亡,并且呋喃唑酮通过诱导细胞内ROS升高从而抑制该通路的活化。为了明确p21在呋喃唑酮诱导的凋亡中的作用,首先我们检测了呋喃唑酮对p21的表达调控。实时荧光定量结果显示,呋喃唑酮处理后细胞内p21mRNA水平急剧升高,但是蛋白表达量显著下降。western blot和免疫荧光对p21蛋白半衰期、泛素化水平以及细胞定位研究发现,呋喃唑酮使p21蛋白半衰期缩短,泛素化增多,稳定性降低,并且蛋白表达发生了核转位。IGF-1使PI3K/Akt信号通路活化后,增加了p21蛋白表达和稳定性,阻止了呋喃唑酮诱导的蛋白核转位。相反,LY294002抑制该通路后,加剧了呋喃唑酮对p21蛋白稳定性和定位的影响。以上结果表明呋喃唑酮通过抑制了PI3K/Akt信号通路从而导致p21蛋白稳定性降低和核转位。接着,我们探讨了p21表达水平的变化对凋亡的影响。通过pCMV-p21表达质粒和p21siRNA转染HepG2细胞,使p21过表达或低表达,呋喃唑酮攻毒后的MTT和凋亡流式结果显示,p21过表达以后提高了HepG2细胞存活率并且凋亡率下降,而siRNA干扰降低p21表达则加剧了呋喃唑酮所致的凋亡现象。Western blot结果显示不同表达水平的p21通过影响呋喃唑酮对caspase-3的活化和PARP剪切从而影响凋亡的发生。通过对胞内ROS水平的检测,发现p21过表达使染毒细胞内ROS水平降低,而p21低表达反之。同时,p21蛋白调控了氧化应激相关的Nrf2/HO-1信号通路,p21过表达通过进一步上调Nrf2和HO-1蛋白激活该通路从而减少氧化损伤。相反p21低表达抑制了细胞在呋喃唑酮刺激下Nrf2/HO-1通路激活现象,降低了细胞抗氧化能力。以上结果表明,p21参与了呋喃唑酮诱导的凋亡过程,通过激活氧化损伤保护通路、降低胞内ROS水平和抑制caspase的活化,抑制了凋亡发生。综上所述,呋喃唑酮可以导致HepG2细胞凋亡的发生,其中可能存在以下机制：呋喃唑酮通过诱导ROS升高,引起线粒体凋亡途径的激活和PI3K/Akt信号通路的抑制,诱导凋亡发生。同时,呋喃唑酮可能通过抑制PI3K/Akt信号通路而降低p21蛋白表达,从而减弱了细胞在氧化应激下的自身保护性通路Nrf2/HO-1通路的激活程度,导致凋亡现象加剧。